柳 覲，倪書邦，孔廣紅，吳 超，賀熙勇

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100)

【研究意義】澳洲堅(jiān)果(Macadamiaspp.)又名昆士蘭栗、澳洲胡桃，為山龍眼科(Proteaceae)澳洲堅(jiān)果屬(Macadamia)常綠喬木，原產(chǎn)于澳大利亞，但大規(guī)模商業(yè)化種植始于夏威夷，因此又稱夏威夷果，其大規(guī)模種植歷史僅有數(shù)十年，是一種新興的高檔堅(jiān)果。澳洲堅(jiān)果果仁口感酥脆，富含多種不飽和脂肪酸和人體必需的氨基酸、微量元素和維生素[1-2]，長(zhǎng)期食用有助于降低心血管疾病的發(fā)生率[3-4]。目前澳洲堅(jiān)果種植范圍包括美國(guó)、澳大利亞、肯尼亞、南非、中國(guó)、東南亞等國(guó)家和區(qū)域，中國(guó)自20世紀(jì)70年代末開始澳洲堅(jiān)果的引種試種，現(xiàn)已成為世界上澳洲堅(jiān)果種植面積最大的國(guó)家，而云南省則是中國(guó)澳洲堅(jiān)果的主產(chǎn)區(qū)[5]。當(dāng)前云南省推廣種植的澳洲堅(jiān)果品種均從國(guó)外引進(jìn)，由于品種選育地與云南種植區(qū)的氣候環(huán)境差別較大，致使大多數(shù)品種的產(chǎn)量等田間表現(xiàn)遠(yuǎn)不及其原始選育地[6-7]，并且近年國(guó)外引種愈加困難，優(yōu)良品種的匱乏已嚴(yán)重制約了中國(guó)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，必須培育出適合中國(guó)種植環(huán)境的澳洲堅(jiān)果優(yōu)良品種。因?yàn)榘闹迗?jiān)果是外來(lái)物種，國(guó)內(nèi)沒(méi)有多樣化的野生種質(zhì)資源可供選種利用。因此，利用人工誘變方式增加現(xiàn)有種質(zhì)資源的變異率，得到具有某種優(yōu)異性狀的突變體植株，進(jìn)而將其選育成為產(chǎn)量、品質(zhì)或抗性表現(xiàn)較好品種，是澳洲堅(jiān)果品種選育的一個(gè)有效途徑。目前常用的誘變方式主要包括EMS誘導(dǎo)[8]、離子注入[9]、磁場(chǎng)處理[10]、太空誘變[11]和γ射線輻照等，其中60Co-γ射線輻照誘變應(yīng)用最為廣泛，在諸多糧食作物和園藝作物上應(yīng)用并取得了一系列成效?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在澳洲堅(jiān)果輻照萌動(dòng)種子誘變育種方面，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。近年來(lái)本研究組以澳洲堅(jiān)果干種子[12]、接穗[13]等為誘變材料，采用60Co-γ射線輻照的方式開展了誘變育種，并對(duì)不同試驗(yàn)材料的誘變效應(yīng)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。【本研究切入點(diǎn)】但萌動(dòng)種子與干種子不同，萌動(dòng)種子的胚組織有絲分裂旺盛，細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行著大量的遺傳物質(zhì)的復(fù)制，對(duì)60Co-γ射線輻照更敏感，基因突變的頻率也更高。以澳洲堅(jiān)果主栽品種云澳57、云澳51、云澳41、云澳58的萌動(dòng)種子為材料，采用不同劑量60Co-γ輻照的方式進(jìn)行誘變處理，對(duì)誘變后代的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀測(cè)，以期建立澳洲堅(jiān)果60Co-γ的輻照誘變育種的系統(tǒng)方法。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探明不同品種對(duì)60Co-γ的輻照誘變的致死劑量和半致死劑量，創(chuàng)制出遺傳意義上全新的澳洲堅(jiān)果新種質(zhì)，豐富澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源，為新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集云澳57、云澳51、云澳41、云澳58共4個(gè)澳洲堅(jiān)果品種的成熟種子，人工脫皮后將殼果置于經(jīng)多菌靈滅菌后的沙床催芽，每天灑水2次以保持沙床濕潤(rùn)。播種1周后將上部的細(xì)沙小心刨去，將殼果灑水沖洗后挑出果殼開裂1 mm以上但芽點(diǎn)尚未突出果殼的萌動(dòng)種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.160Co-γ射線輻照及致死劑量確定 將上述萌動(dòng)種子用劑量為10、25、40、55、70、85、100、115、130的60Co-γ射線進(jìn)行輻照處理，劑量率為10 Gy/h，每個(gè)劑量3次重復(fù)，以同一批催芽裂殼但未經(jīng)輻照的萌動(dòng)種子為對(duì)照。將輻照后的萌動(dòng)種子繼續(xù)置于沙床催芽，每周調(diào)查發(fā)芽率1次，通過(guò)與對(duì)照比較，確定不同品種萌動(dòng)種子的致死劑量和半致死劑量。

1.2.2 誘變苗觀測(cè)及突變體種質(zhì)篩選 對(duì)經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻照后誘變苗的葉長(zhǎng)、葉寬、莖長(zhǎng)、莖粗等性狀參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。待第2輪真葉長(zhǎng)定后，將誘變苗移栽至營(yíng)養(yǎng)袋，待苗高60 cm進(jìn)行大田定植并持續(xù)跟蹤觀測(cè)，定植株行距為2 m×4 m，每年觀測(cè)2次，重點(diǎn)觀測(cè)莖干生長(zhǎng)量、樹形、葉形、分枝和開花情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Microsoft Office Excel 2013軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線輻照對(duì)不同品種澳洲堅(jiān)果萌動(dòng)種子發(fā)芽的影響

對(duì)供試4個(gè)品種的萌動(dòng)種子經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻照后的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)(圖1～4)，60Co-γ射線輻照對(duì)各品種澳洲堅(jiān)果萌動(dòng)種子的發(fā)芽勢(shì)均有明顯的抑制效應(yīng)。輻照劑量越高，萌動(dòng)種子的發(fā)芽時(shí)間越晚、發(fā)芽速率越慢、發(fā)芽率越低。以品種云澳57為例，對(duì)照和經(jīng)10、25 Gy處理后的萌動(dòng)種子從第2周開始發(fā)芽；經(jīng)40 Gy處理后從第3周開始發(fā)芽；經(jīng)55、70、85 Gy處理后從第4周開始發(fā)芽；經(jīng)100 Gy處理后從第5周開始發(fā)芽；經(jīng)115 Gy處理后從第6周開始發(fā)芽；經(jīng)130 Gy處理后的萌動(dòng)種子則沒(méi)有發(fā)芽。品種云澳41無(wú)論是否是輻照后的萌動(dòng)種子，發(fā)芽時(shí)間均要比其他3個(gè)品種晚。

2.2 60Co-γ射線輻照對(duì)不同品種的致死劑量和半致死劑量

發(fā)芽率調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各品種未經(jīng)輻照的萌動(dòng)種子在第6～8周均已全部發(fā)芽或發(fā)芽率已穩(wěn)定；8周后將沙床中未發(fā)芽的萌動(dòng)種子刨出觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有未發(fā)芽種子的芽點(diǎn)已變褐甚至腐爛，已無(wú)后續(xù)發(fā)芽可能；因此以輻照后第8周的發(fā)芽率代表各處理的最終發(fā)芽率，對(duì)不同品種經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻照后的發(fā)芽率進(jìn)行了回歸分析，如圖5～8所示。

供試品種云澳57、云澳51、云澳41、云澳58的輻照劑量(x，Gy)與發(fā)芽率(y， %)間的回歸關(guān)系分別為：y=0.0011x2- 0.9727x+106.26(R2=0.9839)；y=-0.0024x2-0.4576x+103.50(R2=0.9884)；y=-0.0051x2-0.2233x+101.70(R2=0.9281)；y=0.0012x2-1.0402x+105.89(R2=0.9678)。由此回歸方程推算，云澳57、云澳51、云澳41、云澳58對(duì)劑量率為10 Gy的60Co-γ射線輻照的半致死劑量分別為62.22、81.81、81.14、57.55 Gy，致死劑量分別為127.67、133.17、121.01、117.81 Gy，說(shuō)明不同品種澳洲堅(jiān)果萌動(dòng)種子對(duì)60Co-γ射線輻照的敏感性存在差異，其中以云澳51最耐受，而云澳58最敏感。

圖1 60Co-γ射線輻照對(duì)云澳57萌動(dòng)種子發(fā)芽的影響Fig.1 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 57

圖2 60Co-γ射線輻照對(duì)云澳51萌動(dòng)種子發(fā)芽的影響Fig.2 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 51

圖3 60Co-γ射線輻照對(duì)云澳41萌動(dòng)種子發(fā)芽的影響Fig.3 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 41

2.3 60Co-γ射線輻照萌動(dòng)種子對(duì)幼苗形態(tài)的影響

對(duì)不同品種萌動(dòng)種子經(jīng)60Co-γ射線誘變處理后幼苗的形態(tài)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著輻照劑量的增高，植株的變異率也明顯增大。與對(duì)照相比，幾乎所有經(jīng)輻照的誘變苗都出現(xiàn)了植株矮化和莖干增粗的現(xiàn)象，究其原因與60Co-γ射線輻照使萌動(dòng)種子的芽點(diǎn)受到抑制有關(guān)。以品種云澳57為例，最為常見的變異現(xiàn)象是分叉增多，一粒萌動(dòng)種子或出現(xiàn)雙根、或出現(xiàn)雙莖、甚至同時(shí)出現(xiàn)雙根和雙莖(圖9-A)；部分誘變苗表現(xiàn)出須根減少(圖9-B)，或主根變短須根增多的現(xiàn)象(圖9-C)。

圖4 60Co-γ射線輻照對(duì)云澳58萌動(dòng)種子發(fā)芽的影響Fig.4 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 58

圖5 品種云澳57萌動(dòng)種子發(fā)芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.5 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 57 and irradiation dose of 60Co-γ

圖6 品種云澳51萌動(dòng)種子發(fā)芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.6 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 51 and irradiation dose of 60Co-γ

圖7 品種云澳41萌動(dòng)種子發(fā)芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.7 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 41 and irradiation dose of 60Co-γ

圖8 品種云澳58萌動(dòng)種子發(fā)芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.8 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 58 and irradiation dose of 60Co-γ

3 討 論

誘變育種是拓寬澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)、提高種質(zhì)資源遺傳多樣性，創(chuàng)制新種質(zhì)的重要手段。采用澳洲堅(jiān)果萌動(dòng)種子作為誘變材料，萌動(dòng)種子中的細(xì)胞有絲分裂旺盛、遺傳物質(zhì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄非常活躍，遺傳物質(zhì)更易受到射線輻照的影響發(fā)生突變。與前期研究相比[12]，同一品種萌動(dòng)種子的致死劑量、半致死劑量明顯小于干種子，說(shuō)明其對(duì)60Co-γ射線輻照更為敏感，更易于獲得突變體植株。

經(jīng)10和25 Gy的低劑量60Co-γ射線輻照后，品種云澳57、云澳51和云澳41在部分時(shí)間段的發(fā)芽率甚至要高于對(duì)照(CK)，這與前人的研究相一致。此外，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)輻照，品種云澳41開始發(fā)芽的時(shí)間均要比其他3個(gè)品種晚，發(fā)芽率前期增長(zhǎng)較慢，5周后才開始快速增長(zhǎng)，究其原因與其品種特性有關(guān)。不同品種萌動(dòng)種子對(duì)60Co-γ射線輻照的耐受性不同，4個(gè)供試品種的耐受性依次為云澳51>云澳41>云澳57>云澳58。

A：出現(xiàn)雙根、或出現(xiàn)雙莖、或同時(shí)出現(xiàn)雙根和雙莖；B：須根減少；C：主根變短須根增多A: One seedling with double root, or double stem, and double root and double stem at the same time; B: Decrease of the fibrous root; C: Shorter taproot with the increase of fibrous root圖9 云澳57的幼苗變異情況Fig.9 The seedling mutant of macadamia cultivar YunMac 57

半致死劑量(Lethal Dose 50，LD50)是作物誘變育種的重要參數(shù)，多數(shù)研究者認(rèn)為，半致死劑量可作為作物誘變育種的最適宜誘變劑量。經(jīng)半致死劑量誘變處理后，既能保證一定數(shù)量的成活率，又可達(dá)到較高的誘變幾率。經(jīng)不同品種間的比對(duì)和重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果萌動(dòng)種子的半致死劑量為57.55～81.81 Gy，這提示在后續(xù)的以萌動(dòng)種子為材料的60Co-γ射線誘變育種實(shí)踐中，可參照此區(qū)間的輻照劑量進(jìn)行誘變處理。

通過(guò)研究，已初步篩選出了一批在形態(tài)性狀上與對(duì)照有明顯差異的疑似突變體植株，并在大田中進(jìn)行了定植和跟蹤觀測(cè)，但其開花、結(jié)果等農(nóng)藝性狀還有待研究。

4 結(jié) 論

澳洲堅(jiān)果不同品種萌動(dòng)種子對(duì)60Co-γ射線輻照的耐受性不同，澳洲堅(jiān)果萌動(dòng)種子的60Co-γ射線適宜誘變劑量為57.55～81.81 Gy。