農(nóng)澤梅,史國(guó)英,曾 泉,葉雪蓮,秦華東,胡春錦*
(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣西 南寧 530005;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所,廣西 南寧 530007)
【研究意義】甘蔗(Saccharumofficinarum)是我國(guó)重要的糖料作物。宿根蔗栽培是甘蔗的種植生產(chǎn)上一項(xiàng)重要的栽培制度,我國(guó)甘蔗宿根年限一般只有1~2年,但國(guó)外可達(dá)4~7年[1-2]。影響甘蔗宿根年限的主要因素是土壤的質(zhì)量和甘蔗品種的差異。廣西是我國(guó)主要甘蔗和蔗糖產(chǎn)區(qū),但該地區(qū)的土壤類型(赤紅壤)存在耕層薄、肥力偏低、水土養(yǎng)分流失嚴(yán)重等不利因素,超過(guò)2年宿根年限甘蔗表現(xiàn)減產(chǎn)比較嚴(yán)重[3]。根際微生物對(duì)土壤肥力的形成、植物營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化等具有重要作用[4-7],開(kāi)展赤紅壤條件下宿根甘蔗根際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究,對(duì)充分發(fā)揮赤紅壤土壤肥力的維持和提高、激發(fā)蔗區(qū)的生產(chǎn)潛力、選種宿根性良好的甘蔗品種乃至保障我國(guó)蔗糖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展均重要意義。【前人研究進(jìn)展】關(guān)于根際微生物的多樣性及其生態(tài)功能的研究一直廣受關(guān)注[4]。土壤微生物群落多樣性研究可為合理利用資源、解決農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)失衡提供理論依據(jù),同時(shí),植物根際細(xì)菌的研究有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)“植物根系―細(xì)菌”的共生體系協(xié)同進(jìn)化的機(jī)制[8-9]。前人研究表明,作物長(zhǎng)期連作會(huì)嚴(yán)重降低土壤微生物種類和活性,導(dǎo)致植物根際土壤營(yíng)養(yǎng)元素活性降低和微生物群落對(duì)外界抵抗力降低,甘蔗宿根連作引起產(chǎn)量下降等作物連作障礙與其根際微生態(tài)系統(tǒng)失衡有著密切關(guān)系,保持土壤微生物活性是緩解和消除宿根甘蔗衰退的重要措施,也是維持蔗田土壤系統(tǒng)穩(wěn)定性和可持續(xù)發(fā)展的重要保障[10-11]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,不同栽培模式條件下,不同甘蔗品種之間的根際微生態(tài)環(huán)境是存在明顯差異的,如單一的宿根連作導(dǎo)致其根際土壤總微生物量及酶活性下降,引起土壤微生物介導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)受阻,從而導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量下降[12-15]。高欣欣等研究發(fā)現(xiàn)[11],宿根甘蔗土壤與新植甘蔗土壤相比,一些具有重要生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能的微生物種群如固氮菌等數(shù)量呈下降趨勢(shì),但具有代謝甲醇與降解纖維素功能的細(xì)菌種群數(shù)量有所上升。我國(guó)甘蔗主產(chǎn)區(qū)的主要耕作土壤類型為紅壤土或赤紅壤土,具有低pH、低養(yǎng)分含量、硝化與反硝化活性低等特點(diǎn),因此,高投入的種植模式一直是提高甘蔗產(chǎn)量必不可少的措施[16]。然而,過(guò)度依賴投入而忽略自然生態(tài)過(guò)程的種植模式已然不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,必須重視土壤的改良[17-18]。當(dāng)前,利用微生物菌劑來(lái)解決作物的連作障礙問(wèn)題已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展中新的熱點(diǎn)。向土壤中施入微生物菌對(duì)于改善土壤生態(tài)環(huán)境、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有極其重要的作用,特別是對(duì)于具有低pH、低養(yǎng)分含量和易淋溶特性的紅壤或赤紅壤土壤類型,通過(guò)施用土壤改良劑并結(jié)合添加外源微生物菌劑進(jìn)行土壤微生態(tài)環(huán)境改良是非常必要的[19-22]。在眾多的土壤修復(fù)技術(shù)中, 添加土壤修復(fù)劑以及有益農(nóng)業(yè)微生物菌劑是一種既有效又環(huán)保的方法,因?yàn)槲⑸镌谕寥乐形镔|(zhì)和能量的輸入輸出中扮演著非常重要的角色[12-15]。然而,在選用合適的微生物菌劑方面,需要充分考慮到外源微生物與作物以及土壤之間的相互適應(yīng)問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō),選用來(lái)源與菌劑施用的作物土壤環(huán)境具有較高相似性的微生物會(huì)表現(xiàn)出更好的適應(yīng)性。因此,在甘蔗土壤的生態(tài)改良上,施用來(lái)源于甘蔗根際土壤的功能微生物菌劑會(huì)比較有優(yōu)勢(shì)?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于赤紅壤條件下不同品種宿根甘蔗根際可培養(yǎng)細(xì)菌種群的差異,以及宿根蔗根際潛在可利用微生物菌種資源的挖掘和利用,目前還缺乏系統(tǒng)的研究報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬通過(guò)純培養(yǎng)法和基于 16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)同時(shí)種植在赤紅壤條件下、連續(xù)留宿根2年的10個(gè)甘蔗品種工藝成熟前期的根際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究,以期為明確我國(guó)主要蔗區(qū)宿根甘蔗根際細(xì)菌的多樣性、挖掘更多的優(yōu)良甘蔗根際細(xì)菌資源提供科學(xué)支持。
于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地(N 22°50′38.08″,E 108°14′44.65″)開(kāi)展試驗(yàn),試驗(yàn)地土壤類型為赤紅壤土,土壤的基本養(yǎng)分情況見(jiàn)表1。
供試甘蔗品種為10個(gè)來(lái)源于不同國(guó)家或地區(qū)的品種材料:RB86-7515(簡(jiǎn)稱B8,引自巴西)和桂引B9(簡(jiǎn)稱B9)、桂糖21號(hào)(GT21)、桂糖35號(hào)(簡(jiǎn)稱GT35)、桂糖40(GT40)、桂糖41號(hào)(GT41)、桂糖42號(hào)(GT42)、桂糖43號(hào)(GT43)、新臺(tái)糖22號(hào)(簡(jiǎn)稱ROC22)和粵糖93159(簡(jiǎn)稱YT93159)。
表1 供試土壤的基本養(yǎng)分情況分析
供試牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基NA以及細(xì)菌基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基LB參照相應(yīng)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制[23]。
甘蔗的種植管理:10個(gè)甘蔗品種同時(shí)種植在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院的試驗(yàn)地,甘蔗按常規(guī)的種植管理,采用隨機(jī)排列,種植10個(gè)甘蔗品種,連續(xù)留宿根2年。取樣分離甘蔗根際細(xì)菌的時(shí)期為2年宿根甘蔗的工藝成熟前期,取根際土壤進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。土壤樣品采用五點(diǎn)取樣法,宿根蔗大多已長(zhǎng)成一整叢,因此,采樣時(shí)要先去除大約5 cm的表土,再將宿根蔗整兜挖起來(lái),然后收集附著于根系上的土壤,五點(diǎn)土樣混合為一份,去除須根和腐葉等雜質(zhì)并過(guò)篩,最后分別裝入無(wú)菌袋,貼上標(biāo)簽,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行根際細(xì)菌分離。
1.3.1 根際細(xì)菌的分離、計(jì)數(shù)和純化 稱取根際土樣5 g,用45 mL無(wú)菌水稀釋混勻,28 ℃120 r/min搖床溫化培養(yǎng)3 h,然后取100 μl加入900 μl無(wú)菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6進(jìn)行梯度稀釋,分別取梯度10-4、10-5和10-6的稀釋液100 μl均勻涂布在NA培養(yǎng)基平板上,28 ℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),挑取培養(yǎng)性狀不同的單菌落在NA培養(yǎng)基上連續(xù)純化2~3次,最后挑取純化以后的單菌落,轉(zhuǎn)至 NA 斜面培養(yǎng)1~2 d,一份放置于4 ℃短期保存?zhèn)溆?;另一份將菌苔刮下與40 %甘油混合,置于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。所有菌株均保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所植物微生態(tài)菌種保藏室。
1.3.2 根際細(xì)菌的16S rDNA序列分析 PCR擴(kuò)增模板制備: 將供試菌株接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 20 h后離心收集菌體備用。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)從供試菌株的LB培養(yǎng)物中提取小量基因組 DNA,保存于-20 ℃?zhèn)溆?。利用?xì)菌16S 通用引物,正向:27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG),反向:1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT),擴(kuò)增所有供試菌株的16S rDNA 基因。PCR擴(kuò)增按史國(guó)英等[24]的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)和純化后,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行同源性比對(duì)。從Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得最相近的典型菌株的16S rDNA序列,用Clustal X按照最大同源性的原則進(jìn)行排序,并用Neighbor-join法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[25]。
1.3.3 根際可培養(yǎng)細(xì)菌種群的多樣性分析 根據(jù)菌株16S rDNA序列分析結(jié)果對(duì)所分離獲得的根際細(xì)菌進(jìn)行種屬分類,利用群落數(shù)學(xué)生態(tài)學(xué)的研究方法分析和比較甘蔗不同品種根際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性。細(xì)菌多樣性分析參考任強(qiáng)等[26]的方法,采用Marglef豐富度指數(shù),Shannon-Wiener多樣性指數(shù)表示,指數(shù)計(jì)算公式如下:
(1) Marglef豐富度指數(shù)dma:dma=(S-1)/lnN
式中,S為物種數(shù)目,N為所有物種的個(gè)體數(shù)之和。
(2) Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H′:H′ =-∑PilnPi
式中,Pi=Ni/N,Ni為第i種的個(gè)體數(shù)。
群落中生物種類越多代表群落的復(fù)雜程度增高,即H′值愈大,多樣性越高,群落所含的信息量愈豐富。
采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及制圖,并以SPSS 18.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。
利用NA培養(yǎng)基對(duì)10個(gè)不同品種宿根蔗根際土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌分離和純化,共獲得167株根際細(xì)菌,結(jié)果見(jiàn)表2;菌株編號(hào)為N15101~N15300,其中甘蔗品種B8和YT93159的可培養(yǎng)根際細(xì)菌的數(shù)量最多,而B(niǎo)9的根際細(xì)菌數(shù)量最少。從表2可見(jiàn),不同甘蔗品種根際細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)(dma)、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(H′),存在顯著差異(P<0.05),豐富度指數(shù)為1.8034~3.6719,Shannon-Wiener多樣性指數(shù)則為1.1730~2.3161,其中以甘蔗品種B8的菌株個(gè)體數(shù)、豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均為最高;其次為品種GT43,它的根際細(xì)菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)分別為3.2461和2.1661;品種YT93159的根際細(xì)菌菌株個(gè)數(shù)雖然也比較多,但其多樣性指數(shù)僅為1.61;品種GT43的根際細(xì)菌多樣性指數(shù)最低,僅為1.1730。
對(duì)所有獲得的可培養(yǎng)根際細(xì)菌均進(jìn)行了16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序,序列通過(guò) BLAST 程序與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析。所有供試菌株與Gen Bank中已報(bào)道菌株均具有較高的相似性(≥97 %),167株甘蔗根際細(xì)菌在種屬水平上,可以劃分為31個(gè)不同分類單元,即可歸類于31個(gè)不同菌屬(表3和圖1)。
選取31個(gè)不同菌屬的代表菌株及其相似性最高菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。16S rDNA序列分析結(jié)果表明,167株宿根蔗根際細(xì)菌主要分屬于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)4大類群(表3,圖 2)。類群Firmicutes主要包含Bacillussp.、Paenibacillussp.、Paenisporosarcinasp.和Lysinibacillussp.等菌屬,其中Bacillussp.是所有可培養(yǎng)根際細(xì)菌中的最優(yōu)勢(shì)菌屬,占41.92 %;類群Bacteroidetes主要包含Chryseobacteriumsp.、Pedobactersp.、Flavobacteriumsp.、Chitinophagasp.、Olivibactersp.、Niabellasp.等菌屬,其中Chryseobacteriumsp.是所有分離菌株中的第二大優(yōu)勢(shì)菌屬,占10.78 %;類群Actinobacteria只包含Microbacteriumsp.、Streptomycessp.、Micrococcus sp.等菌屬,均為非優(yōu)勢(shì)菌;類群Proteobacteria包含的菌屬最多,共有Enterobactersp.、Acinetobactersp.、Pseudomonassp.、Ensifersp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.等18個(gè)菌屬,都屬于非優(yōu)勢(shì)菌屬,僅在部分或者個(gè)別甘蔗品種的根際分離獲得,但Acinetobactersp.在甘蔗品種GT40的根際細(xì)菌中屬于優(yōu)勢(shì)菌屬,占該品種可培養(yǎng)根際細(xì)菌種群的29.4 %。
表2 不同品種宿根蔗根際細(xì)菌的多樣性比較
注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。
Note: Different lowercase letters in same column represented significant difference at 0.05 level.
表3 不同品種甘蔗根際細(xì)菌基于16S rDNA序列分析的分類鑒定結(jié)果
續(xù)表3 Continued table 3
序號(hào)Serial number菌屬種類Species of bacteria genera不同品種甘蔗根際細(xì)菌菌株數(shù)量Rhizosphere bacteria stains number of different varieties sugarcaneGT21B8GT35GT43GT41ROC22B9GT42GT40YT9315924Niabella sp.000100000025Kosakonia sp.000010000026Micrococcus sp.000001000027Caulobacter sp.000000100028Cronobacter sp.000000000129Sphingobium sp.000000000130Pseudoxanthomonas sp.000000100031Escherichia sp.0000000010 合計(jì) Total16201516161714161720
圖1 來(lái)源于10個(gè)不同品種宿根蔗根際細(xì)菌的主要種屬類群餅狀圖Fig.1 The pie chart owning to the taxonomy of rhizosphere bacteria from 10 ratoon sugarcane cultivars
根際是土壤中圍繞著植物根的一個(gè)狹窄的區(qū)域。由于根系分泌物的選擇作用,通常根際微生物的種類較少[27]。本研究從10個(gè)種植在赤紅壤條件下宿根甘蔗的根際土壤中分離獲得167株根際細(xì)菌,它們?cè)诨?6S rDNA序列分析結(jié)果上屬于31個(gè)不同的菌屬。該結(jié)果顯示2年宿根蔗根際細(xì)菌還是比較豐富的,但其主要優(yōu)勢(shì)菌群比較單一,最大的優(yōu)勢(shì)菌屬是芽孢桿菌屬(Bacillussp.),占所有可培養(yǎng)根際細(xì)菌的41.92 %,其次為金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.),占10.78 %,其它29個(gè)菌屬的菌株數(shù)量占比均不高,僅在部分或者個(gè)別甘蔗品種的根際土壤中分離獲得。究其原因可能是由于宿根蔗根系土壤的營(yíng)養(yǎng)與化學(xué)環(huán)境相對(duì)比較穩(wěn)定,有利于根系環(huán)境中優(yōu)勢(shì)微生物菌群的發(fā)展,但是,相對(duì)穩(wěn)定的根系環(huán)境又容易使菌群趁于單一,并不利于維持根系微生物的多樣性。本研究在一定程度上反映了不同甘蔗品種間根系微生態(tài)區(qū)系的差異,如10個(gè)甘蔗品種的根際細(xì)菌群落豐富度指數(shù)在1.8034~3.6719,表現(xiàn)為B8>GT43>GT42>ROC22>GT40>YT93159>GT41>B9>GT21>GT35;Shannon多樣性指數(shù)為1.1730~2.3161,其中除了品種桂引B8和GT43的多樣性指數(shù)分別達(dá)到2.3161和2.1661以外,其它8個(gè)品種的H′均低于2.0,多樣性指數(shù)最低的是GT35,僅為1.1730。前人研究結(jié)果表明,微生物多樣性的降低以及結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致植物根際土壤營(yíng)養(yǎng)元素活性降低和微生物群落對(duì)外界抵抗力降低的重要原因,維持作物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,保持微生物活性是緩解和消除宿根甘蔗衰退的重要措施,也是維持蔗田土壤系統(tǒng)穩(wěn)定性和可持續(xù)發(fā)展的重要保障[1, 11, 28]。因此,從本研究結(jié)果來(lái)看,甘蔗品種B8和GT43相比較其它8個(gè)品種表現(xiàn)出良好的宿根性優(yōu)勢(shì)。該結(jié)果為進(jìn)一步研究“甘蔗―根際細(xì)菌”的互作及其協(xié)同進(jìn)化關(guān)系提供了一定的理論依據(jù)。但是,由于影響甘蔗宿根年限的主要因子眾多,如土壤營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、根系分泌物積累、土壤微生物區(qū)系變化以及病蟲(chóng)害發(fā)生等,而本研究只分析了根際可培養(yǎng)細(xì)菌這一項(xiàng)指標(biāo),未能全面反映甘蔗根系微生物的變化,因此,不同品種根際可培養(yǎng)細(xì)菌菌群的差異是否與甘蔗的宿根性相關(guān)?在土壤微生態(tài)環(huán)境改良的措施上,品種選擇是否可以作為一個(gè)重要的參考指標(biāo)?相關(guān)問(wèn)題仍有等進(jìn)一步的研究。由于自然界中只有0.1 %~1 %的微生物能通過(guò)常規(guī)方法能被培養(yǎng),僅占自然界中微生物種類的極小部分[29]。因此,在今后的進(jìn)一步研究中,應(yīng)采用多種培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行分離培養(yǎng),并結(jié)合利用不依賴純培養(yǎng)的分子生物學(xué)的方法來(lái)研究根際未培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物,才能更全面地了解宿根甘蔗的根際微生物種群信息。
本研究從宿根甘蔗的根際土壤中分離獲得167株可培養(yǎng)根際細(xì)菌,在基于16S rDNA序列分析結(jié)果上屬于31個(gè)不同的菌屬,其中最大優(yōu)勢(shì)種群為芽孢桿菌屬(Bacillussp.),占41.92 %,表明宿根甘蔗根際細(xì)菌中可能存在許多具有應(yīng)用潛力的菌種資源,是根際促生細(xì)菌的重要資源庫(kù)。Bacillussp.屬內(nèi)的多種細(xì)菌在農(nóng)業(yè)上已得到廣泛利用。如巨大芽孢桿菌(B.megaterium)是一種解磷促鉀細(xì)菌,能夠分解土壤中的吸附態(tài)有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷;阿氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)具有較強(qiáng)的纖維素分解能力[30-32]。這 2種細(xì)菌作為優(yōu)勢(shì)種群存在于土壤細(xì)菌中,有利于土壤中磷和纖維素的分解,提高土壤肥力,促進(jìn)作物的生產(chǎn)。此外,芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(B.methylotrophicus)等細(xì)菌對(duì)植物病原真菌或病原細(xì)菌具有抑制作用,是具有較好開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的生防細(xì)菌[33-34]。本研究獲得的宿根甘蔗根際細(xì)菌的另一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌群黃金桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)的許多種也是重要的有機(jī)物降解菌,具有降解土壤中殘留化學(xué)農(nóng)藥等生物學(xué)功能;而其它主要菌群,如假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、土地桿菌屬(Pedobactersp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)和微桿菌(Microbacteriumsp.)等菌屬的許多種均具有固氮、生防和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等重要生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能[35-36]。這些菌群在開(kāi)發(fā)新型微生物肥料、研制高效微生物農(nóng)藥或者作為微生物接種劑促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)以及通過(guò)微生物降解來(lái)治理環(huán)境、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的上都具有良好的應(yīng)用潛力。宿根甘蔗根際細(xì)菌的主要種群中包含許多具有潛在應(yīng)用價(jià)值的微生物菌種資源。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究“甘蔗―根際細(xì)菌”的互作及其協(xié)同進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù)。
本研究反映了赤紅壤條件下宿根甘蔗根際具有豐富的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性,但是優(yōu)勢(shì)菌群比較單一,不同甘蔗品種間存在顯著差異,其中甘蔗品種B8和GT43根際細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均相比較高,具有維持宿根甘蔗根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的相對(duì)優(yōu)勢(shì)。