李俊麗，鄒正康，劉 倩，陸芹洪，楊道勇

(武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院生物系，湖北 武漢 430070)

【研究意義】鐵是植物生長發(fā)育過程中不可缺少的元素之一，它參與葉綠素的合成，影響光合作用的氧化還原系統(tǒng)，植物一旦缺少鐵就會出現(xiàn)葉片黃化等問題。植物體內(nèi)有著一套完整的吸收、轉(zhuǎn)運和利用鐵的機制[1]。土壤中的鐵含量很高，但是可以被植物吸收利用的鐵較少[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常常通過外源添加鐵肥來改善植物缺鐵的狀況[3]。然而，在施加傳統(tǒng)鐵肥時，鐵離子易與土壤中的物質(zhì)結(jié)合為難溶化合物，同時Fe2+也易轉(zhuǎn)化為Fe3+而失效，不易被植物吸收[4]，因此找一個合適的補鐵材料已經(jīng)迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M展】納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料相比于普通塊體材料有著獨特的微小結(jié)構(gòu)和特異的性能，如小尺寸效應(yīng)、表面與界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等[5]。納米材料作為一種新型材料，由于其優(yōu)異的理化性質(zhì)而在很多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-9]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于大量施用化學(xué)肥料，出現(xiàn)肥料利用率低、導(dǎo)致水體污染、臭氧層破壞和加劇溫室效應(yīng)等環(huán)境問題。因此，合理、高效施用化肥，提高肥料利用效率，成為當(dāng)前急需解決的重要問題。目前已有較多研究將納米添加劑、納米增效劑應(yīng)用到肥料中，研究其對作物生長的影響。納米氧化鐵是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的納米材料之一，具有許多新性能，如較大的比表面積，超順磁性以及固有的生物相容性等，因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、藥物控釋、分離技術(shù)以及環(huán)境工程等領(lǐng)域。之前已有研究報道過不同納米氧化鐵對植物的積極作用[10-12]，也有研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鐵對植物產(chǎn)生了毒害作用。由于目前納米氧化鐵對植物幼苗生長發(fā)育的效果不一，因此還需開展大量相關(guān)實驗，以闡明其機制?！颈狙芯壳腥朦c】本文通過對不同納米氧化鐵處理的小麥幼苗的各項生理指標的測定，探討了不同種類納米氧化鐵對小麥幼苗生長發(fā)育的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】小麥是三大谷物之一，是一種常見的農(nóng)作物，僅2017年中國河南省小麥的產(chǎn)量就高達3550萬t[13]。由于小麥在世界各地的廣泛種植，以及其重大的食用價值，本試驗選用小麥作為研究對象，探究適宜濃度的三種不同納米氧化鐵(α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4)和鐵離子(Fe2+、Fe3+)處理下植物的抗氧化酶體系、細胞膜脂質(zhì)過氧化程度以及葉綠素、根系活力等生理生化指標的影響。為評估納米氧化鐵對作物生長發(fā)育的影響及其作為鐵肥在農(nóng)業(yè)上使用提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥為河南新鄉(xiāng)的豫農(nóng)小麥新麥18號，納米材料購自于麥克林公司。選取籽粒飽滿、無病蟲害、無損壞、大小均一的小麥種子約600顆用于試驗。

1.2 試驗方法

小麥種子經(jīng)5 %次氯酸鈉溶液(v∶v)消毒10 min后用去離子水浸泡4 h。浸泡后用紗布包裹，于30 ℃的暗箱中催芽48 h。將長勢良好的幼苗于濾紙上見光培養(yǎng)72 h。隨后選取長勢均勻的幼苗移入水培盆中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在移入水培盆4 d(去離子水和1/4缺鐵改良霍格蘭培養(yǎng)液培養(yǎng)各2 d)后，進行試驗處理，將試驗分為7個處理組，每組40株幼苗，此外每個處理組都進行3次重復(fù)試驗。將幼苗分別用濃度為50 mg/L(以Fe元素濃度計)的納米α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、加鐵改良霍格蘭培養(yǎng)液(normal)和缺鐵改良霍格蘭培養(yǎng)液(CK)處理1周,隨后將所有幼苗同一位置的葉片及所有根系取0.3 g分別剪切并研磨，作為酶液進行實驗檢測，每個指標均有3個平行組。其中，設(shè)置Fe2+、Fe3+處理組是為了研究離子的植物毒害作用，F(xiàn)e(II)-EDTA是常用的螯合鐵肥，在這里作為陽性對照，在實驗室預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選用了50 mg/L這個促進植物生長的最適濃度。在處理前，納米粒子均在去離子水中進行超聲分散，直至得到混合均勻的懸浮液。培養(yǎng)時光照強度為20 000 lx，光/暗周期設(shè)置為28 ℃、16 h/18 ℃、8 h，每3 h通氣30 min。

1.3 生理生化指標的測定

1.3.1 生理指標的測量 根的長度使用直尺測量；丙二醛(MDA)含量使用硫代巴比妥酸法進行檢測[14]；超氧化物歧化酶(SOD)活性使用四氮唑藍法進行檢測[15]；過氧化氫酶(CAT)活性使用紫外吸收法進行檢測[16]；過氧化物酶(POD)活性使用愈創(chuàng)木酚法[17]進行檢測；小麥的根系活力使用甲醇浸泡TTC法進行檢測[18]；可溶性糖含量使用蒽酮-硫酸比色法進行檢測[19]；可溶性蛋白含量使用考馬斯亮藍法進行檢測[20]；花青素含量使用鹽酸乙醇浸提法進行檢測[21]；葉綠素含量使用乙醇浸提法進行檢測[22]。實驗中所選用樣品都經(jīng)超聲處理以洗去表面吸附物。

1.3.2 根和葉中Fe含量分析 選取處理后長勢均勻的小麥幼苗，在超聲清洗器(KQ2200B，100 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)中超聲10 s以洗凈幼苗表面吸附物質(zhì)，然后，置于60 ℃烘48 h。取100 mg烘干的根或葉分別置于3 mL濃硝酸中于100 ℃金屬浴中消解2 h。待冷卻至室溫后，向其中加入0.5 mL 30 % H2O2，100 ℃消解0.5 h。鐵含量通過原子吸收分光光度計測定。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗中每個處理都進行了3次重復(fù)，結(jié)果表示為“平均值±標準偏差”。實驗數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 22進行了Duncan多重比較(P≤0.05)進行統(tǒng)計分析。最后使用origin7.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉綠素含量及鐵分布情況

對于植物地上部來講，葉綠素是一個判斷植物生長發(fā)育狀況的重要指標。葉綠素是一類與光合作用有關(guān)的色素，它是最為重要的光合色素。在一定范圍內(nèi)，光合強度隨其含量增加而加強。因此它是反映植物豐產(chǎn)性能的生理指標之一。葉綠素的含量還可以在一定程度上檢測植物毒性[23]。經(jīng)不同處理后，小麥幼苗葉的葉綠素含量變化如圖1A所示，不同處理組葉綠素含量沒有表現(xiàn)出明顯差異，可能是因為葉中粒子的濃度還不太大，還不足以影響植物葉綠素的含量。從圖1B可以看出，不同處理下的小麥幼苗的根和葉中Fe含量有較大差異，3種納米材料處理的小麥幼苗根中的Fe含量是顯著大于兩種離子處理的，在納米材料處理的3組中，α-Fe2O3處理中Fe含量最高，γ-Fe2O3次之，F(xiàn)e3O4最少，2種離子處理的幼苗則沒有顯著差異。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特殊理化性質(zhì)，這些特性使納米粒子更容易被小麥根部吸收[24]，本實驗也證明了這一點。而葉中的情況則與根中相反，F(xiàn)e2+處理的幼苗葉中Fe含量約是納米材料處理中的2倍，可見離子比納米材料更容易在植物中轉(zhuǎn)運運輸。有研究表明，植物能夠吸收納米材料并通過木質(zhì)部或韌皮部進一步的轉(zhuǎn)移到植物的其他部分[25]，但轉(zhuǎn)運系數(shù)較低[26]，這與本研究中的發(fā)現(xiàn)一致。

2.2 小麥根生長狀況和根系活力

同樣，植物的地下部分也十分重要。植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的活力水平直接影響地上部的營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。不同處理下小麥幼苗根的生長狀況如圖2A所示，相比于其他處理組，F(xiàn)e3+處理下的小麥根較稀疏，較短一些，圖2B的結(jié)果也證實了這一點，F(xiàn)e3+處理組比對照組根長減少了43.01 %。其他處理之間則沒有顯著差異，表明Fe3+有一定的植物毒性，減少了小麥的根系生長。在Adams等人的研究中，發(fā)現(xiàn)納米粒子能夠吸附在植物的根部[27]，在我們的研究中，也觀察到了類似的現(xiàn)象，從圖2A中，可以明顯的看到，3種納米材料處理的小麥幼苗根部吸附了大量的物質(zhì)，使其表觀顏色有了明顯的變化。納米材料在植物根部的富集也為植物吸收納米粒子提供了可能性。除根長外，另一個能夠直接判斷植物根部生長狀況的指標是根系活力。植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的活力水平直接影響地上部的營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。不同處理下的小麥幼苗的根系活力如圖2C所示，只有Fe3+處理的植株根系活力顯著升高，有研究表明，當(dāng)植物根系因受到脅迫而導(dǎo)致生長減少時，植物會通過增加根系活力來補償根系吸收面積的減小[28]，與本研究的結(jié)果一致,這表明Fe3+對小麥植物產(chǎn)生了一定的脅迫，但納米粒子未表現(xiàn)出植物毒性，與Fe3+處理的毒害作用相比較，可以表明，納米粒子對植物產(chǎn)生作用的方式并非釋放Fe3+，而是通過其他方式對植物產(chǎn)生影響[29]。

2.3 小麥幼苗根和葉中丙二醛含量

當(dāng)植物遭受干旱、鹽、重金屬等脅迫時，細胞中會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)[30-32]。在細胞內(nèi)大量積累的活性氧會損害細胞，損傷之一就是導(dǎo)致膜脂過氧化，從而破壞膜結(jié)構(gòu)。丙二醛是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量植物脅迫的重要指標。在對不同處理下小麥幼苗根和葉中丙二醛含量(圖3)的分析中，可以看出，無論是根還是葉中，相比于對照組和正常處理組，F(xiàn)e2+和Fe3+處理組的丙二醛都有顯著的升高。而納米材料處理的3個組中，只有納米Fe3O4處理的小麥根MDA含量較正常處理組略有上升。而納米α-Fe2O3處理的小麥葉中MDA含量較正常處理組下降了30.55 %。小麥幼苗在離子處理下產(chǎn)生了很大的氧化脅迫，并且造成了較大的膜損傷，其原因可能是相對于處理前的生長環(huán)境，大量的Fe2+和Fe3+在短時間內(nèi)形成了一個逆境，使得MDA含量較高[33]。而這一指標顯示納米材料并未對植物產(chǎn)生脅迫。

圖中CK代表缺鐵改良霍格蘭培養(yǎng)液處理，normal代表加鐵改良霍格蘭培養(yǎng)液處理。圖中字母不同代表差異顯著。下同CK represents iron deficiency and improved hogland culture solution treatment, while normal represents iron and improved hogland culture solution treatment. The letters in the picture represent significant differences. The same as below 圖1 不同處理下小麥幼苗葉的葉綠素含量及葉和根的Fe含量Fig.1 Chlorophyll content in wheat seedling leaves under different treatments and Fe content of leaves and roots of seedlings under different treatments

圖2 不同處理下小麥幼苗根的生長狀況，根長和根系活力Fig.2 Root growth,root length and root activity of wheat seedlings under different treatments

圖3 小麥幼苗根和葉中丙二醛含量Fig.3 Content of MDA in root and leaf of wheat seedling

2.4 小麥幼苗根和葉中花青素含量

為了保護細胞免受活性氧的潛在傷害，植物體發(fā)展了一套完整的防御體系，花青素就是其中重要的一員。花青素是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的黃酮類化合物，此前的很多研究都表明，花青素與植物抗逆性有關(guān)，當(dāng)植物遭受脅迫時，花青素含量上升[34-35]。如圖4所示。在根中，除納米α-Fe2O3處理使得花青素含量相比于對照組和正常處理組增多外，其他處理間沒有顯著性差異。而在葉中，3種納米材料的處理使得葉的花青素含量相比于正常處理組下降，但與對照組相比沒有顯著差異。總的來說，納米材料的處理在一定程度上降低了植物葉的花青素含量，離子處理對花青素含量沒有影響，說明納米粒子并未對植物造成脅迫。

圖4 小麥幼苗根和葉中花青素含量Fig.4 Anthocyanins in roots and leaves of wheat

圖5 小麥幼苗根和葉中超氧化物歧化酶(SOD)活性,過氧化氫酶(CAT)活性和小麥幼苗根和葉中過氧化物酶(POD)活性Fig.5 SOD activity,CAT activity and POD activity in root and leaf of wheat seedlings

2.5 小麥幼苗根和葉中抗氧化酶活性

2.6 小麥幼苗根和葉可溶性蛋白和可溶性糖含量

小麥幼苗根和葉中可溶性蛋白的含量如圖6A所示。可溶性蛋白也可以在細胞受損時起到保護作用，可溶性蛋白是細胞的重要組成部分，通過代謝等途徑來調(diào)節(jié)細胞滲透壓[38]，且蛋白質(zhì)參與細胞的所有新陳代謝活動。其含量在生物體內(nèi)維持著一定程度的代謝平衡，而當(dāng)植物受到一定的脅迫或者自身發(fā)育生長衰老時，這一平衡才會有所波動[39]。從圖中可以看出，不同處理下小麥根中的可溶性蛋白含量沒有顯著差異，而在葉中，F(xiàn)e2+處理組的小麥葉可溶性蛋白含量相比于對照組和納米α-Fe2O3、Fe3+處理組有明顯上升，相比于對照組也上升了27.47 %，納米Fe3O4處理組的可溶性蛋白含量相比于納米α-Fe2O3和Fe3+處理組也上升了，因此，納米Fe3O4與Fe2+顯示出了一定的毒性，且該圖中蛋白質(zhì)含量的變化與圖4中3種酶含量的變化基本一致。

可溶性糖作為生物體一種重要的能源物質(zhì)，也參與細胞中的一些應(yīng)激反應(yīng)，在植物遭受脅迫時，會合成可溶性糖以提高植物抗性。研究表明，在脅迫下，植物體內(nèi)可溶性糖的含量與MDA含量呈正相關(guān)[40]。如圖6B所示，在小麥葉中，F(xiàn)e2+和Fe3+處理組的可溶性糖含量比對照組和正常處理組對比都有明顯上升，F(xiàn)e3+處理組的根中的可溶性糖含量相比于對照組也升高了51.46 %，這與圖3中MDA含量的變化一致。說明50 mg/L的離子處理對植物造成了一定的氧化脅迫。此外，納米Fe3O4處理下的小麥葉中可溶性糖的含量也有所上升。

3 討 論

本文主要研究3種納米氧化鐵和兩種離子對小麥幼苗生理效應(yīng)的影響，通過小麥幼苗葉綠素、Fe含量、根系活力、抗氧化酶體系的酶活性、MDA等生理生化指標的變化來進行評估。Fe含量分析的結(jié)果表明，在50 mg/L的Fe元素濃度下，3種納米粒子(α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4)和兩種離子(Fe2+、Fe3+)處理的小麥幼苗植株根和葉中Fe含量都高于對照組和正常處理組，其中納米粒子處理組中Fe的總含量要高于離子處理組，可能是由于納米粒子粒徑較小，易被吸收，但離子處理組的轉(zhuǎn)運率(從根到葉)更高，目前關(guān)于納米顆粒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制還不清楚，有學(xué)者認為只有粒徑小于0.5 nm的顆粒才能在植物體內(nèi)運輸[41]，這也可能是本實驗中轉(zhuǎn)運系數(shù)低的主要原因，這啟發(fā)之后可以設(shè)計不同粒徑的納米氧化鐵來進行試驗，以期找到一個更好的納米氧化鐵作為鐵肥。從理論上來看，這5個處理確實可以起到補鐵的作用，但是，從對小麥生理指標檢測的結(jié)果來看，F(xiàn)e2+和Fe3+處理比3種納米氧化鐵展現(xiàn)出了更大的植物毒性，具體表現(xiàn)為膜脂過氧化程度加劇、抗氧化酶體系(SOD、CAT、POD酶)中酶活性上升、可溶性糖含量增加等。3個納米氧化鐵處理組的比較中，納米Fe3O4表現(xiàn)了較大的毒性，而α-Fe2O3和γ-Fe2O3處理的小麥幾乎沒有表現(xiàn)出毒性，但卻起到了補鐵的作用。因此，選用納米材料進行補鐵是一個可行的方向，進一步研究納米粒子進入植物的途徑以及在植物體內(nèi)存在的形式，并加深到相關(guān)調(diào)控機制的分子層面可能會有新的突破。

圖6 不同處理下小麥幼苗根和葉中的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量Fig.6 Soluble protein content soluble sugar content in roots and leaves of wheat seedlings under different treatments

4 結(jié) 論

綜上所述，高濃度離子型Fe的添加對植物生長造成了脅迫，而納米α-Fe2O3和γ-Fe2O3展現(xiàn)了較小的植物毒性，且易被植物吸收利用，可以考慮在缺鐵的情況下嘗試用于農(nóng)業(yè)中代替?zhèn)鹘y(tǒng)鐵肥，以緩解植物的缺鐵癥狀?？紤]到納米材料對環(huán)境問題和人體健康問題的危害還不清楚，因此在實際應(yīng)用前還需仔細展開納米粒子安全性的研究。