劉冬梅，婁喜艷，喻 擁，李 瑤，裴冬麗*

(1. 商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院植物與微生物互作省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000；2. 商丘工學(xué)院土木工程系，河南 商丘 476000)

【研究意義】棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物。 陸地棉是世界上種植最廣泛的棉花種類，占全棉產(chǎn)量的90 %。 異源四倍體物種衍生自作為父本Gossypiumraimondii，提供了D基因，以及作為母本的A基因組物種G.Arboreum。他們在五千至一千萬年前分化，在一百至兩百萬年前重新團(tuán)聚起來形成陸地棉。

【前人研究進(jìn)展】轉(zhuǎn)錄控制是細(xì)胞或生物體調(diào)節(jié)其基因表達(dá)的主要機(jī)制，轉(zhuǎn)錄因子(TFs)是通過結(jié)合其啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)節(jié)幾個(gè)其他基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。除了正常的基因轉(zhuǎn)錄控制之外，它們還可以作為對環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是目前發(fā)現(xiàn)的最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，有研究表明，WRKY蛋白在防御包括細(xì)菌，真菌和病毒病原體在內(nèi)的各種生物脅迫的植物防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們在發(fā)育過程中也起著重要的調(diào)控作用，如毛狀體啟動(dòng)，胚胎形態(tài)發(fā)生，衰老以及植物激素如赤霉酸，脫落酸，或水楊酸。也有越來越多的證據(jù)表明WRKY蛋白參與了對各種非生物脅迫的反應(yīng)。在擬南芥中，微陣列分析顯示，一些WRKY轉(zhuǎn)錄物在響應(yīng)各種非生物脅迫如鹽度，干旱和寒冷時(shí)受到強(qiáng)烈調(diào)控。在水稻中，非生物脅迫(寒冷，干旱和鹽度)或各種植物激素處理下，54個(gè)WRKY基因在轉(zhuǎn)錄本豐度上表現(xiàn)出顯著差異。在大麥中，WRKY基因Hv-WRKY38在受到寒冷和干旱脅迫時(shí)表達(dá)，而在大豆中至少有9種WRKY基因在非生物脅迫下差異表達(dá)[2]，值得注意的是，單個(gè)WRKY基因可以通過與幾種VQ蛋白(具有VQ連接的基序，包括SIB1和SIB2(西格瑪因子相互作用蛋白))調(diào)節(jié)多種非生物脅迫來調(diào)節(jié)多種非生物反應(yīng)[3]。

自從第1個(gè)編碼WRKY蛋白SPF1的cDNA 由 Ishiguro 和 Nakamura在甘薯中克隆出來后，更多的WRKY基因在不同植物中被發(fā)現(xiàn)，尤其是在禾本科植物中，包括野生燕麥，水稻，小麥等[4]。近年來，隨著高通量測序工作的實(shí)施，許多物種的測序工作都已經(jīng)完成，棉花WRKY基因家族包含116個(gè)基因[5]。WRKY蛋白因含有約60個(gè)氨基酸的1個(gè)或2個(gè)域指定的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名。在其N端含有一段保守的氨基酸基序WRKYGQK，在C端含有一個(gè)新型的C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X-H，X可以是任意的非保守氨基酸)或C2HC(C-X7-CX23-H-X-C)鋅指結(jié)構(gòu)[6]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY蛋白可分為3類。I類有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，II類有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步分為5個(gè)亞類(II-a、II-b、II-c、II-d和II-e)，III類有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和 C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)[7]。WRKY結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘牟煌樖阶饔肈NA元件顯示出高結(jié)合親和力稱為W盒(T/CTGACC/T)[8]。W盒已經(jīng)在許多涉及防御和應(yīng)對環(huán)境壓力的基因的啟動(dòng)子中鑒定出，W盒也存在于WRKY基因啟動(dòng)子本身中，表明WRKY基因是自我調(diào)節(jié)的，并且還可以調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)[9]。

有研究表明，WRKY70積極參與油菜素類固醇(BR)調(diào)節(jié)的生長，并且負(fù)面地參與干旱反應(yīng)[10]。鷹嘴豆CaWRKY70通過調(diào)控CaHDZ12表達(dá)，從而影響植株的抗旱和耐鹽能力[11]。以擬南芥為模型系統(tǒng)，WRKY70通過激活SA信號(hào)通路調(diào)控由蠟狀芽孢桿菌AR156引發(fā)的誘導(dǎo)型全身抗性(ISR)[12]。油菜BnWRKY70基因表達(dá)程度與其植株的抗病性呈正相關(guān)[13]。擬南芥中的WRKY70同時(shí)參與了防御丁香假單胞菌侵染和RPP4調(diào)控的抗霜霉病過程，并通過與RCY1抗病蛋白作用來調(diào)節(jié)擬南芥抗黃瓜花葉病毒[14]。陸地棉WRKY3在根、莖和葉中形成并通過調(diào)節(jié)各種植物激素(包括水楊酸、脫落酸、茉莉酮酸甲酯、乙烯、赤霉素等)進(jìn)行表達(dá)[15]。對WRKY轉(zhuǎn)錄因子在二倍體A和D棉花品種中的綜合比較研究中， 總共鑒定了112G.raimondii和109G.arboreumWRKY基因。在2種物種之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的基因結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域改變，但許多SNP在外顯子和內(nèi)含子區(qū)域分布不均勻[16]。據(jù)已有文獻(xiàn)顯示，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與棉花花藥的發(fā)育[17]。在野生大豆中。WRKY基因家族成員GsERKY20參與調(diào)控植物開花時(shí)間[18]。NAC和WRKY的共同表達(dá)在調(diào)控芝麻MS中起關(guān)鍵作用[19]。在擬南芥中，WRKY34轉(zhuǎn)錄因子已被證明參與其花粉的發(fā)育[20]，表明該轉(zhuǎn)錄因子在不同植物體中的功能基本相似，推測GhWRKY70也有上述部分或全部功能。

【本研究切入點(diǎn)】根據(jù)前人研究結(jié)果，WKY70轉(zhuǎn)錄因子參與多個(gè)生物學(xué)過程，其中包括調(diào)控開花時(shí)間。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，WKY70轉(zhuǎn)錄因子在陸地棉洞A在不育系不育花藥中表達(dá)高于可育花藥，推測該基因與棉花雄性不育相關(guān)。本文克隆了該基因并對其結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因在雄性不育和可育花藥中的差異表達(dá)，為了進(jìn)一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)。

【擬解決的關(guān)鍵問題】該基因的克隆和結(jié)構(gòu)分析為棉花雄性不育基因功能和雄性不育機(jī)理的研究提供前提，也為棉花雄性不育材料的創(chuàng)造提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 陸地棉洞A不育系花藥(花蕾d=3～4 mm)。

1.1.2 試劑 DL2000 DNA Marker購自全式金公司， ExTaq聚合酶、rTaq聚合酶、solution1 連接酶、pMD18-T載體，M購自TaKaRa公司，DNA 凝膠回收試劑盒購自東盛公司，Trizol試劑購自上海閃晶分子生物科技有限公司，ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA的合成 RNA提取參照Trizol(上海閃晶)試劑說明書操作步驟。

cDNA合成參照ReverTra Ace qPCR RT Kit(東洋紡)試劑說明書操作步驟。

1.2.2GhWRKY70轉(zhuǎn)錄因子的克隆 利用Primer 5設(shè)計(jì)GhWRKY70轉(zhuǎn)錄因子全長引物，引物序列Unigene19749-F：NNNNGGATCCATGGGAAGTGTGTCAGCTTGGC；Unigene19749-R：NNNNG TCGACCTA GACCAACTCACTTTCATCAAACTG N(A,T,C或G)。

GhWRKY70轉(zhuǎn)錄因子全場基因PCR擴(kuò)增體系為：10×ExTaqbuffer 5 μl；10 mM dNTPs 1 μl；Primer-s 1 μl；Primer-as 1 μl；cDNA 1 μl；0.5 μl；加ddH2O至 50 μl。其PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火63 ℃，1 min；延伸72 ℃，50 s；終延伸72 ℃，10 min；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物T載體的連接 將克隆所得片段使用試劑盒進(jìn)行膠回收，并與pMD18-T連接。T載體連接體系solution1 5 μl；片段 4 μl；載體1 μl，20 ℃過夜連接。

1.2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及載體轉(zhuǎn)化 方法參照張麗霞，賈海燕(2013)一種簡便高效大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法[21]。

1.2.5 轉(zhuǎn)化后大腸桿菌的克隆及測序 以菌液為模版進(jìn)行克隆，用Primer 5程序設(shè)計(jì)菌液PCR檢測引物H-19749-1-F GGTTGGGATTTTGGGGTTGC；H-19749-1-R GACTGGAAGATGCTGGCTCC。菌液檢測PCR體系10×rTaqbuffer 2 μl；10 mM dNTPs 0.2 μl；Primer-s 0.3 μl；Primer-as 0.3 μl；菌液 1 μl；rTaq0.2μl；ddH2O 16 μl。其PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火60 ℃，40 s；延伸72 ℃，50 s；終延伸72 ℃，10 min；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。將結(jié)果送上海生物工程公司測序，通過多次比對序列，最后得出完整序列。

1.2.6 電泳 ① 瓊脂糖凝膠制備：稱取0.4 g的瓊脂糖，加入40 mL的TBE，放入微波爐中加熱溶解，煮沸3次至完全溶解，待膠涼至60～70 ℃時(shí)，倒平板凝固。② 點(diǎn)樣：將RNA提取液(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或待檢測的菌液)和Loding Buffer按照5∶1的比例混勻點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，點(diǎn)2個(gè)樣。③ 電泳條件：電壓120 V，電泳15 min。④ 染色：跑完電泳后，膠片在EB中浸泡30 min。⑤ 觀察：紫外光下觀察電泳條帶。

1.2.7 預(yù)測與分析 通過NIBI在線軟件ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測GhWRKY70氨基酸個(gè)數(shù)以及蛋白質(zhì)序列。用在線軟件SMAR(http://smart.embl-heidelberg.de/)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。

利用Expasy數(shù)據(jù)庫中的在線軟件Prot Param(http://web.expasy.org/protparam/)分析并預(yù)測GhWRKY70蛋白的理化性質(zhì)。

用swiss-model分析軟件(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.8 引物設(shè)計(jì) 通過Primer 5設(shè)計(jì)引物，轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY 70在不育和可育花藥中的表達(dá)進(jìn)行Q-PCR檢測，以棉花泛素蛋白基因?yàn)閮?nèi)參用，差異表達(dá)分析引物如下：H-1975-F：GCCTCCAATTGTCCCCTTCA；H-1975-R：TACGCAAACTGTTCACCCGA，片段長度161 bp。根據(jù)導(dǎo)出數(shù)據(jù)計(jì)算各指標(biāo)的平均Ct值、ΔCT值及ΔΔCT值，并計(jì)算檢測指標(biāo)的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

從圖1可以看出，條帶清晰，沒有拖帶現(xiàn)象，RNA無降解，分光光度計(jì)測定RNA濃度為175.08 ng/μl，純度(A260/A280)為2.147，可用于基因克隆模板。

2.2 Gh WRKY70全長基因的克隆

從圖2可以看出，其位置處于750～1000 bp中間，片段大小與目的基因相符，條帶清晰。

2.3 檢測菌液PCR

根據(jù)菌液PCR檢測結(jié)果(圖3)，挑取陽性克隆，送公司測序。

M:DL2000 Marker；1:棉花不育花藥總RNA圖1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄Fig.1 RNA extraction and reverse transcription

M:DL2000 Marker ；1：PCR所得基因克隆產(chǎn)物圖2 Gh WRKY70基因全長的克隆Fig.2 Full-length gene cloning of Gh WRKY70

M:DL2000 Marker；1～2：PCR所得菌液克隆產(chǎn)物圖3 檢測菌液PCR Fig.3 Detection of bacteria PCR

2.4 測序及提交

將獲得的全長基因送上海生物工程公司測序，得到GhWRKY70完整編碼區(qū)序列，該基因全長為918 bp，將測序所得到的GhWRKY70完整編碼區(qū)序列通過BackIt提交到NCBI，Gene BANK號(hào)為MF278614。

2.5 蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5.1 Gh WRKY70蛋白質(zhì)序列GhWRKY70基因編碼305個(gè)氨基酸，該蛋白只有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，包含61個(gè) aa其位置處于128～191，E值為4.44e-36，在292～301處還有1個(gè)組成低復(fù)雜性序列區(qū)域(圖4)。

2.5.2 Gh WRKY70蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 Gh WRKY70蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)α螺旋(Hh)為98個(gè)，占全部結(jié)構(gòu)的32.13 %，延伸鏈(Ee)37個(gè)，占全部結(jié)構(gòu)的12.13 %，13個(gè)β轉(zhuǎn)角(Tt)，占全部結(jié)構(gòu)的4.26 %，無規(guī)則卷曲有157個(gè)(Cc)，占全部結(jié)構(gòu)的51.48 %(圖5)。

2.5.3 Gh WRKY70蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 在對Gh WRKY70進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果中顯示，該蛋白只有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果一致，說明預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確。將生成的 PDB 結(jié)果在 SWISS-pdb Viewer 軟件中觀察蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明Gh WRKY70三維空間結(jié)構(gòu)主要是由β-折疊和無規(guī)則卷曲組成(圖6)。

圖4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Protein domain analysis

圖5 GhWRKY70蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of GhWRKY70 protein

圖6 Gh WRKY70蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Gh WRKY70 protein tertiary structure

2.6 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

在Gh WRKY70蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析結(jié)果中顯示，該蛋白有305個(gè)氨基酸，由19種氨基酸組成，分子量：34648.65，理論等電點(diǎn)：5.97，分子式：C1502H2366N426O490S13。在WRKY70的氨基酸序列中Ser的使用頻率最高，為10.5 %。WRKY70蛋白總的負(fù)電荷殘基數(shù)為46個(gè)，正電荷殘基數(shù)為41個(gè)，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)較高，為50.81，指數(shù)大于40，表明該蛋白是不穩(wěn)定的。WRKY70蛋白親水性較強(qiáng)，氨基酸殘基疏水性總和(GRAVY)為-0.838。

2.7 同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

運(yùn)用MEGA5軟件對陸地棉(MF278614GossypiumhirsutumWRKY70)和煙草(KM510344.1NicotianatabacumWRKY70)、擬南芥(AF421157.1ArabidopsisthalianaWRKY70)、小麥(LC068769.1TriticumaestivumWRKY70)、甘藍(lán)(KM593152.1Brassicaoleraceavar WRKY70)、蕓苔(KF430076.1BrassicarapaWRKY70)、辣椒(KF484401.1CapsicumannuumWRKY70)、玉米(NM_001154348.1ZeamaysWRKY70)、水稻(BK005073.1OryzasativaWRKY70)、大豆(NM_001315509.1GlycinemaxWRKY70)、粗山羊草亞種(XM_020312323.1Aegilopstauschiisubsp WRKY70)、芭蕉亞種(XM_009417198.2Musaacuminatasubsp WRKY70)、可可(XM_018129667.1TheobromacacaoWRKY70)、亞洲棉(XM_017749682.1GossypiumarboreumWRKY70)、西瓜(GQ453670.1CitrulluslanatusWRKY70)15個(gè)序列進(jìn)行同源性分析, 使用鄰近法(NJ method)， bootstrap 設(shè)為 1000，構(gòu)建進(jìn)化樹，其結(jié)果顯示GhWRKY70與亞洲棉的系統(tǒng)進(jìn)化樹在同一支上，同源性最高，可可在另一個(gè)分支上，相比之下同源性次之。水稻和玉米在最遠(yuǎn)的分支上，則與其同源性最差(圖7)。

2.8 Gh WRKY70基因在不育和可育花藥中的差異表達(dá)分析

從圖8可以看出，GhWRKY70基因在不育花藥中的表達(dá)顯著高于可育花藥，表明該基因可能與洞A雄性不育有關(guān)，Q-pCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的重要性。

圖7 陸地棉Gh WRKY70基因的同源進(jìn)化樹分析Fig.7 Analysis of Gh WKY70 gene in upland cotton based on homologue evolutionary tree analysis

圖8 GhWRKY 70基因在不育和可育花藥中的差異表達(dá)Fig.8 Differential expression of GhWRKY 70 in sterile and fertile anther

3 討 論

通過本次研究，對GhWRKY70基因有了一個(gè)初步的了解。該基因全長918 bp，根據(jù)軟件分析，預(yù)測編碼305個(gè)氨基酸。在GhWRKY70編碼的蛋白中，只有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2-HC(C-X7-C-X23-H-X1-C)型的鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第III類，該類轉(zhuǎn)錄因子只在高等植物中存在[22]。開花植物中的WRKY III基因被認(rèn)為起源于單子葉植物和真核生物的分歧。擬南芥III組成員的時(shí)間表達(dá)分析支持這些成員是不同植物防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一部分，包括相容，不相容和非宿主相互作用，表明它們的功能分化。因此，WRKY III基因在植物適應(yīng)和進(jìn)化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 WRKY III基因被認(rèn)為是進(jìn)化方面最先進(jìn)的，并且在適應(yīng)性方面最為成功的[23]。該蛋白WRKY結(jié)構(gòu)域中高度保守的WRKYGQK這七個(gè)氨基酸序列并不是一成不變的，有些植物的WRKY成員的這七個(gè)序列中的W、Q和K會(huì)出現(xiàn)變異，而且Q位點(diǎn)突變頻率最高[24]。擬南芥WRKY 結(jié)構(gòu)域中存在的Q突變?yōu)镵。水稻W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域中存在Q突變?yōu)镋。WRKY結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的某些功能的減弱甚至喪失。下一步工作將基因轉(zhuǎn)入陸地棉或擬南芥中，驗(yàn)證該基因功能，為創(chuàng)造棉花雄性不育材料奠定基礎(chǔ)。