李孝瓊，陳 穎，韋 宇，郭嗣斌

(廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】稻褐飛虱和稻瘟病是嚴重影響水稻生產的兩大病蟲害。褐飛虱具有生長周期短、繁殖力強、易遷飛等生活習性，主要通過刺吸危害，嚴重時會導致大面積“冒穿”，造成水稻減產和絕收[1]；此外，褐飛虱還通過傳播狀叢矮病毒和齒葉矮縮病毒等[2]，給水稻生產帶來損失。稻瘟病(Rice blast disease)是由子囊菌[Magnaporthegrisea(Hebert) Barrnov.]引發(fā)的真菌性病害，在全球80多個國家和地區(qū)均有發(fā)生，在我國造成的稻谷年損失量嚴重時高達1×109kg[3]。降低水稻病蟲害最經濟、有效、環(huán)保的策略就是發(fā)掘鑒定出廣譜持久高抗的基因，并在此基礎上培育和推廣高抗病蟲害的品種。然而，常規(guī)抗病蟲育種方法容易受環(huán)境因素的影響，對表型選擇不準確，從而導致育種效率低。分子標記輔助選擇(Molecular Marker-assisted Selection, MAS)育種不受外界因素影響，利用與目標基因緊密連鎖(或基因內)的標記，對目標單株進行標記基因型鑒定，結合農藝性狀進行篩選，可以有效提高育種效率、縮短育種周期，常用于連續(xù)回交育種對受體的目標性狀進行定向改良，是現代分子育種的重要手段[4]。利用MAS技術聚合高抗褐飛虱和稻瘟病的基因，培育新的多抗品種，對水稻生產具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，隨著分子生物學及生物信息學的發(fā)展，越來越多的水稻抗褐飛虱基因被定位克隆，至今已有35個抗褐飛虱基因被鑒定，其中66.6 %的基因分布在第4號和第12號染色體上，29個基因被定位于水稻7條染色體的不同區(qū)域。目前，已經被克隆的褐飛虱抗性基因有位于水稻第4號染色體上的Bph3[5]和Bph6[6]、位于第12號染色體上的Bph9[7]、位于第3號染色體長臂端的Bph14[8]、位于第12號染色體長臂的Bph18[9]和Bph26[10]以及位于第6號染色體的Bph29[11]、Bph32[12]和Bphi008a[13]?？沟疚敛』虻难芯恳踩〉昧溯^大進展，已經被鑒定和定位的抗稻瘟病基因超100個，這些基因成簇分布，大部分基因分布于第6、11和12號染色體上，少數基因分布在除第3和11號染色體外的其他染色體上。在定位的主效基因中，Pi1[14]、Pi2[15]、Pi9[16]、Pigm[17]、Pid3[18]、Pizt[15]、Pi56[19]、Pia[20]、Pib[21]、Pita[22]等26個抗稻瘟病基因已被成功克隆，并廣泛應用于抗病育種中?！颈狙芯壳腥朦c】目前市場推廣的主要水稻品種中，抗褐飛虱的品種為數不多，聚合抗褐飛虱和抗稻瘟病基因的品種更少，培育的品種大多為單基因抗性品種，專一性較強，難以滿足生產需求。為了防范單基因抗病蟲害品種大面積、長時間種植后出現抗性喪失問題，有必要進一步拓寬抗病蟲基因的材料基礎，鑒定克隆出抗譜不同的抗病蟲基因[23]?！緮M解決的關鍵問題】通過雜交、回交和自交，結合MAS技術和抗病蟲性鑒定，將Pi9導入本身含有褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的優(yōu)異恢復系桂恢1561中，從中選育出聚合Bph14、Bph15和Pi9基因的既抗褐飛虱又抗稻瘟病的優(yōu)質恢復系中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

輪回親本為含Bph14和Bph15雙抗褐飛虱純合基因的恢復系材料桂恢1561(來源于以IR24 為受體親本的小粒野生稻基因導入系，由本研究組自主選育完成)[24]；抗病供體親本為恢復系材料桂99+Pi9(來源于桂99/IR75-1-172，由湖北農業(yè)科學院戚華雄老師提供)；稻褐飛虱感蟲對照TN1，抗蟲對照RH，抗蟲鑒定的稻褐飛虱捕捉于廣西農業(yè)科學院水稻研究所的試驗田中，于玻璃溫室中培養(yǎng)約3個世代作為接種蟲源。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因聚合育種流程 以抗褐飛虱恢復系桂恢1561為輪回親本，桂99+Pi9為父本進行雜交、2次回交及2次自交；從BC1F1世代開始對回交后代進行MAS，從分離群體中選出含抗稻瘟病基因Pi9的植株繼續(xù)與輪回親本進行回交；自交2次后選擇Bph14、Bph15和Pi93個抗性基因都純合、農藝性狀優(yōu)良的株系用于褐飛虱苗期抗性鑒定及稻瘟病田間自然誘發(fā)抗性鑒定(圖1)。

1.2.2 分子標記 所篩選的與褐飛虱抗性基因Bph14、Bph15緊密連鎖的多態(tài)性分子標記分別為MRG2329和MS5[25]，稻瘟病抗性基因Pi9的特異性標記為M-Pi9[26]。3對引物均為共顯性標記，由華大基因合成。由于本研究中所用的輪回親本為抗蟲親本桂恢1561，所以在回交選育的過程中沒有對抗蟲基因Bph14和Bph15進行標記檢測，標記MRG2329、MS5用于BC2F2群體中檢測選擇Bph14、Bph15基因純合單株。

圖1 MAS改良桂恢1561抗性技術路線Fig.1 The technical approach of improving blast resistance of Guihui1561 by MAS

表1 水稻苗期褐飛虱抗性鑒定評價標準

Table 1 Evaluation standard of screening resistant varieties to rice brown planthopper

抗性級別Resistance grade description死苗率(%)Death rate抗性水平Resistance0≤1.0免疫11.0～10.0高抗310.0～30.0抗530.0～50.0中抗750.0～70.0中感9≥70.0感

1.2.3 PCR反應體系和反應程序 采用改良CTAB法提取水稻幼嫩葉片DNA。PCR反應總體積為15 μl，其中DNA 模板2 μl，2×TaqPCR Master Mix 6 μl，10 nmol/L 的正反向引物各0.5 μl，加ddH2O補足15 μl。引物MS5的PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min后進行35個循環(huán)擴增，循環(huán)條件為94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸45 s，循環(huán)結束后再72 ℃延伸5 min，反應結束后體系于4 ℃保存；引物MRG2329和M-Pi9的PCR反應程序退火溫度為58 ℃，其他條件與MS5相同。MRG2329和MS5的PCR擴增產物在濃度為8 %的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，銀染，保鮮膜包膠保存并記錄結果。在M-Pi9的PCR 擴增產物中加入核酸染料，用濃度為2 %的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并記錄結果。

1.2.4 褐飛虱苗期抗性鑒定 采用苗期集團法進行褐飛虱抗性鑒定，在廣西農業(yè)科學院植物保護研究所進行。試驗材料為桂恢1561、桂99+Pi9、RH、TN1以及改良恢復系BC2F3的GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18株系。種子浸種催芽后，播于塑料方盆(52 cm×35 cm×8 cm)中，每個秧盤中間播抗感對照RH和TN1，每盤播4個材料，每個材料播3行，每行25粒，設2次重復。當秧苗長到二葉一心時，剔除弱苗和死苗，按5頭/株的蟲量接入2～3齡的褐飛虱若蟲，在感蟲對照品種TN1死苗率達到95 %時，統(tǒng)計各株系的死苗率及抗性級別(表1)。

1.2.5 稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定 自然誘發(fā)病圃設在稻瘟病多發(fā)區(qū)廣西岑溪市梨木鎮(zhèn)高圍村，面積約0.7 hm2。病圃常年處于高溫、高濕的氣候環(huán)境中，具有利于發(fā)病的地理環(huán)境條件，歷年稻瘟病發(fā)生嚴重。病圃全生育期不噴殺菌劑，殺蟲劑的使用量根據病圃蟲害發(fā)生的程度而定。共進行2次病情調查：移栽前的苗葉瘟調查和黃熟期的穗頸瘟調查。苗葉瘟調查在每個株系的發(fā)病中心選擇有代表性的病叢，以發(fā)病最重的20～50張葉片平均發(fā)病等級作為該株系的抗性級別；穗頸瘟調查每小區(qū)至少100穗。田間的栽培管理、調查方法、病級劃分、記載標準和抗性評價按顏群等[27]的水稻品種試驗抗性鑒定方法與標準執(zhí)行?？剐跃C合指數=苗葉瘟病級×25 %+穗頸瘟發(fā)病率病級×25 %+穗頸瘟損失率病級×50 %。

1.2.6 農藝性狀考察 2018年2月下旬播種，3月下旬移栽，于大田種植試驗材料，每個材料種植2行，每行10株，正常水肥管理，于成熟期進行農藝性狀考察。每個材料選擇中間8株，考察性狀，主要包括株高、生育期、單株有效穗數、穗長、每穗粒數、結實率及千粒重等，取平均值為其表型值。

2 結果與分析

2.1 親本間的多態(tài)性檢測

由圖2可知，MRG2329在桂恢1561中擴增出的產物片段較大，在桂99+Pi9中擴增出的產物片段較?。籑S5和M-Pi9的產物擴增結果與MRG2329相同。3對引物的PCR產物均在親本間有明顯多態(tài)性，可用于該育種群體各世代中的分子標記檢測。

A-M：分子量標準；1、3：抗蟲親本桂恢1561；2、4：感蟲親本桂99+Pi9；B-M：分子量標準；1：抗病親本桂99+Pi9；2：感病親本桂恢1561A-M: DNA Marker; 1, 3: Resistance parent Guihui1561; 2, 4: Susceptible parent Gui99+Pi9; B-M: DNA Marker 1: Resistant parent Gui99+Pi9; 2: Susceptible parent Guihui1561圖2 引物MRG2329、MS5和M-Pi9在親本間的多態(tài)性鑒定結果Fig.2 Identification of polymorphism among parents using primers MRG2329, MS5 and M-Pi9

M：分子量標準；1：抗病親本桂99+Pi9；2：感病親本桂恢1561；3～12：BC1F1單株M: DNA Marker 1: Resistant parent Gui99+Pi9; 2: Susceptible parent Guihui1561; 3-12: BC1F1 population圖3 引物M-Pi9對BC1F1的單株篩選Fig.3 Screening of BC1F1 by primer M-Pi9

1：抗蟲親本桂恢1561；2：改良株系; TN1：感蟲對照；RH：抗蟲對照；9：托盤編號1: Resistance parent Guihui1561; 2: GH18-1 Improved lines GH18-1; TN1: Susceptible CK; RH: Resistance CK; 9: Tray number圖4 苗期集團法鑒定褐飛虱抗性Fig.4 Identification of resistance to brown planthopper by seedling group method

2.2 分離世代的單株檢測

恢復系回交改良過程中選擇保留含Pi9抗性基因且農藝性狀優(yōu)良的單株進行回交。在BC1F1群體中，共檢測了20個單株，其中有9個單株含Pi9雜合基因，部分檢測結果見圖3(6、7、8、10、11和12為含目標基因的雜合體)。在BC2F1群體中共檢測了20個單株，其中含Pi9合基因的有8株，混收獲得BC2F2。大區(qū)種植BC2F2，并利用分子標記MRG2329、MS5和M-Pi9對單株進行檢測，共檢測到17株含3個抗性基因的純合單株，從中篩選獲得GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18等4個農藝性狀與桂恢1561相近的改良恢復系單株。

2.3 親本及改良株系的褐飛虱及稻瘟病抗性鑒定與比較

2次褐飛虱苗期抗性鑒定結果表明，感蟲親本桂99+Pi9對褐飛虱的抗性為中感，而抗蟲親本桂恢1561的抗性略低于抗性對照RH；桂恢1561改良株系GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18均達到抗級水平，4個株系之間抗性區(qū)別不大，其中抗性最好的是GH18-18(表2，圖4)。

在2018年上半年對鑒定材料進行了苗葉瘟抗性鑒定和黃熟期穗頸瘟抗性鑒定。與親本桂恢1651相比，改良株系GH18-18稻瘟病抗性明顯提高，穗頸瘟抗級達到3.8級；輪回親本桂恢1561對稻瘟病抗性綜合指數為6.8級，抗性評價為感，桂恢1561的4 個改良株系抗性綜合指數均在4級以下，抗性評價為抗，其中抗性表現最好的是GH18-7(表3，圖5)。綜合褐飛虱及稻瘟病抗性鑒定結果，桂恢1561改良株系GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18既抗褐飛虱又抗稻瘟病。

2.4 親本及改良株系的農藝性狀評價與比較

如表4所示，與輪回親本相比，4個改良株系的3個農藝性狀得到了不同程度的改良，主要表現為生育期縮短，單株有效穗數增加，千粒重降低；除了GH18-18，其余3個株系的株高均比親本桂恢1561高；穗長變短，每穗總粒數有2個株系較輪回親本高，結實率都在80 %以上。結果表明，在含抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的親本桂恢1561中導入抗稻瘟病基因Pi9是可行的，對產量性狀影響不大，部分農藝性狀甚至優(yōu)于輪回親本。

表2 褐飛虱苗期抗性鑒定結果

表3 稻瘟病抗性鑒定結果

表4 正常水田條件下的農藝性狀表現

圖5 稻瘟病抗性鑒定Fig.5 Rice blast resistance identification

3 討 論

當前，許多抗病蟲基因已經被成功定位和克隆，且有一部分被廣泛應用于抗性育種中，抗病蟲的水稻品種培育也取得了一定進展。根據分子設計育種的原理與要求，通過MAS技術進行基因聚合，將不同的抗病蟲基因相組合將會為新育成水稻品種提供更加穩(wěn)定和持久的抗性[28]。

利用MAS技術聚合水稻抗性基因的研究成果頗豐，一些水稻新品系已成功選育，且部分品種(組合)已經通過審定。倪大虎等[29]利用MAS技術將Xa23和Pi9基因聚合在一起，聚合系既抗白葉枯病又抗稻瘟病，抗性和抗譜均與親本相當。Liu等[30]利用MAS技術將2個抗褐飛虱基因Bph3和Bph27(t) 導入易感品種Ningjing 3中，得到的聚合系在很大程度上提高了對褐飛虱的抗性，避免了由于褐飛虱影響而造成的產量損失。李進波等[24]以GD-7為稻瘟病抗性基因供體、揚稻6號為受體，通過回交轉育結合MAS，選育出10個雙基因(Pi1和Pi2)純合且農藝性狀優(yōu)良的水稻新品系。Xiao等[31]將抗白葉枯病基因Xa23以及抗褐飛虱基因Bph14和Bph15通過分子標記輔助回交策略導入恢復系華占中，不僅提高了華占的抗性，而且改良后水稻的產量也有所增加。孫富等[32]以含廣譜稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的材料BL122為供體親本，紅色特種秈稻桂紅一號為受體親本，通過雜交、回交和自交并結合MAS技術，將Pi1和Pi2基因導入桂紅一號中，獲得了攜帶2個抗性基因的高抗稻瘟病改良材料。

然而，目前已成功選育和推廣的水稻品種中，抗褐飛虱的品種僅占少數，聚合抗褐飛虱基因和抗稻瘟病基因的品種更少。本研究組自2012年起在廣西岑溪市建立了稻瘟病鑒定點，綜合幾年的試驗結果，發(fā)現含Pi9基因的材料田間抗性表現最好。優(yōu)質恢復系桂恢1561具有抗褐飛虱、綜合農藝性狀優(yōu)良、配合力好等優(yōu)點。本研究以桂恢1561為輪回親本，與稻瘟病抗性材料桂99+Pi9進行雜交和回交，通過稻瘟病和褐飛虱抗性鑒定及評價，結合分子標記輔助選擇技術，篩選出了一批與輪回親本桂恢1561遺傳背景相近且含Bph14、Bph15和Pi9雙抗病蟲害純合基因的材料。在本研究成果的基礎上，本研究組將繼續(xù)開展以下育種實踐：繼續(xù)種植4個改良株系材料，系選使其農藝性狀穩(wěn)定；用雙抗病蟲害的穩(wěn)定恢復系與生產上骨干三系不育系廣泛測優(yōu)配組，培育抗病蟲害強優(yōu)組合，加快生產應用。

4 結 論

通過常規(guī)回交育種、分子標記輔助選擇和抗病蟲鑒定相結合的方法，篩選獲得了4份聚合褐飛虱抗性基因(Bph14和Bph15)和稻瘟病抗性基因Pi9的水稻病蟲害雙抗中間材料，為選育新的雙抗恢復系提供種質資源。