任樹(shù)軍 梁彥林 姜磊 任明輝 王墉琦 耿慧春 于雪峰 譚福柱*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040 3.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710001 4.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，江西 南昌 330003

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)一詞由Pommer[1]于1885年首先提出，1950年以來(lái)，許多學(xué)者都對(duì)其進(jìn)行了比較精確的闡述。美國(guó)學(xué)者W.A.Peck認(rèn)為骨量丟失，骨組織顯微結(jié)構(gòu)及骨脆性改變引起骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的疾病稱為OP；日本的井上哲郎認(rèn)為OP的一個(gè)典型特征為骨組織內(nèi)單位體積的骨量減少。對(duì)于OP明確的定義是1993年在香港舉辦的骨質(zhì)疏松國(guó)際研討會(huì)上提出的，并得到醫(yī)學(xué)界大多數(shù)專家的認(rèn)可[2]。在流行病學(xué)研究[3-4]中發(fā)現(xiàn)，過(guò)度飲酒能使骨密度降低，對(duì)年輕女性的危害較絕經(jīng)后老年女性的危害更加顯著，屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松范疇。酒精濫用和酒精依賴導(dǎo)致的骨壞死、骨質(zhì)疏松、骨折發(fā)生率正逐漸增加，通過(guò)研究骨密度(bone mineral density，BMD)、骨礦含量(bone mineral content，BMC)的變化，探討酒精對(duì)骨代謝的作用機(jī)制，無(wú)疑對(duì)治療酒精性骨質(zhì)疏松(alcoholic osteoporosis，AOP)[5]具有更重要的意義。

本研究通過(guò)建立酒精性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，觀察不同時(shí)期各組實(shí)驗(yàn)大鼠BMD、BMC的變化，進(jìn)一步探討生髓健骨膠囊在防治AOP大鼠方面的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用成年雄性(清潔級(jí))SD大鼠120只，體重(220±20)g，平均約6個(gè)月月齡，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(黑)20170130]。根據(jù)隨機(jī)法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為正常對(duì)照組、模型組、碳酸鈣+阿法D3組(西藥對(duì)照組)及生髓健骨膠囊組(中藥干預(yù)組)，每組各30只，在適宜的環(huán)境中分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱大鼠體重。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

正常對(duì)照組每天用等量生理鹽水(500 mL/袋，出廠批號(hào)：B1708018，四川太平洋藥業(yè)有限公司)進(jìn)行灌胃，上午、下午各1次;模型組每天上午用等量白酒(500 mL/瓶，紅星牌二鍋頭，55°，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T20822，北京紅星股份有限公司生產(chǎn))灌胃，下午用與正常對(duì)照組相同量的生理鹽水灌胃，各1次;西藥對(duì)照組每天上午用等量白酒(同模型組)灌胃，下午給予碳酸鈣(500 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10980201，吉林萬(wàn)通藥業(yè)集團(tuán))+阿法D3[0.25 μg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20080612，以色列梯瓦制藥工業(yè)(TEVA)有限公司(昆明貝克諾頓公司分裝)]用生理鹽水(同正常對(duì)照組)配成混懸液灌胃給藥，各1次;中藥干預(yù)組每天上午用等量白酒(同模型組)灌胃，下午給予生髓健骨膠囊(0.35 g/粒，批準(zhǔn)文號(hào)：黑衛(wèi)藥制字Z20110036，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)用生理鹽水(同正常對(duì)照組)配成混懸液灌胃給藥，各1次。

各組實(shí)驗(yàn)大鼠均按10 mL/kg容積灌胃給藥，白酒按約含純乙醇4.4 g/(kg·d)計(jì)量，共持續(xù)給藥16周。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均給予規(guī)定(全價(jià)標(biāo)準(zhǔn))營(yíng)養(yǎng)飼料，自由進(jìn)食水。各組實(shí)驗(yàn)大鼠每周末通過(guò)稱量體重變化來(lái)調(diào)整給藥劑量。嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理道德，于造模8、12、16周末，將各組實(shí)驗(yàn)大鼠分別采取頸椎脫臼法處死10只，在無(wú)菌操作環(huán)境下取出左側(cè)股骨，將殘余組織剔除后，用生理鹽水沖洗，再用無(wú)菌濕紗布包敷，最后用雙能X線骨密度儀(DEXA)檢測(cè)。將股骨上端放置于雙能X線骨密度儀(DEXA)探頭下，用小動(dòng)物學(xué)軟件進(jìn)行掃描處理，對(duì)各組大鼠左側(cè)股骨的BMD、BMC進(jìn)行檢測(cè)，最后打印出測(cè)定結(jié)果。

1.3 主要儀器

采用美國(guó)通用(Lunar)公司生產(chǎn)的雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x(PLODIGY-型)附帶的小動(dòng)物軟件測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠的骨密度;游標(biāo)卡尺由桂林廣陸數(shù)測(cè)股份有限公司生產(chǎn)(精確度0.02 mm、長(zhǎng)150 mm)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T21389-2008。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPASS 22.0進(jìn)行(組間單因素ANOVA)檢驗(yàn)，行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠8周末檢測(cè)股骨BMD、BMC的結(jié)果比較(表1)

組別例數(shù)BMD/(g/cm2)BMC/(g/cm2)正常對(duì)照組100.272±0.0220.149±0.017模型組100.228±0.027★★0.116±0.008★★西藥對(duì)照組100.239±0.025▲0.123±0.018▲中藥干預(yù)組100.244±0.021▲▲●0.130±0.019▲▲●F值-12.73327.746P值-<0.001<0.001

注：與正常對(duì)照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與西藥對(duì)照組相比，●P<0.05，●●P<0.01。

2.2 各組大鼠12周末檢測(cè)股骨BMD、BMC結(jié)果的比較(表2)

組別例數(shù)BMD/ (g/cm2)BMC/ (g/cm2)正常對(duì)照組100.271±0.0180.148±0.037模型組100.222±0.023★★0.109±0.015★★西藥對(duì)照組100.235±0.021▲0.119±0.025▲中藥干預(yù)組10 0.253±0.017▲▲●0.135±0.026▲▲●F值-29.94017.164P值- <0.001<0.001

注：與正常對(duì)照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與西藥對(duì)照組相比，●P<0.05，●●P<0.01。

2.3 各組大鼠16周末檢測(cè)股骨BMD、BMC結(jié)果的比較(表3)

組別例數(shù)BMD/(g/cm2)BMC/(g/cm2)正常對(duì)照組100.270±0.0210.147±0.033模型組100.206±0.026★★0.098±0.012★★西藥對(duì)照組100.230±0.024▲0.120±0.021▲中藥干預(yù)組100.259±0.020▲▲●0.144±0.022▲▲●F值-15.9909.754P值-<0.001<0.001

注：與正常對(duì)照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與西藥對(duì)照組相比，●P<0.05，●●P<0.01。

2.4 造模干預(yù)8、12、16周末骨密度指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

模型組BMD、BMC與對(duì)照組相比均有不同程度的下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果表明乙醇能夠引起實(shí)驗(yàn)大鼠骨量減少，BMD、BMC下降；中藥干預(yù)組、西藥對(duì)照組的BMD、BMC分別與模型組相比明顯升高(P<0.01、P<0.05)，且中藥干預(yù)組優(yōu)于西藥對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

BMD能直接反應(yīng)骨礦物質(zhì)的變化，與BMC息息相關(guān)。BMD降低，骨強(qiáng)度減低，骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)升高。因此，BMD是評(píng)估臨床療效的主要依據(jù)，也是骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)性的重要標(biāo)志。當(dāng)骨量丟失超過(guò)5%，即可被骨密度儀(雙能X線)檢測(cè)出。

3 討論

3.1 酒精性骨質(zhì)疏松(AOP)概述

AOP目前是一種發(fā)病機(jī)制尚不清楚的骨代謝疾病?，F(xiàn)代研究表明長(zhǎng)期過(guò)量的酒精攝入將通過(guò)多途徑影響骨代謝平衡，使成骨減少、破骨增加，導(dǎo)致骨量減少。過(guò)量飲酒會(huì)帶來(lái)以下影響[5]：①對(duì)鈣調(diào)節(jié)激素[1,25(OH)2D3、降鈣素及甲狀旁腺激素]的影響；②對(duì)腎上腺皮質(zhì)類固醇激素的影響；③對(duì)性腺功能產(chǎn)生的影響；④對(duì)骨細(xì)胞的影響：抑制成骨細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞；⑤對(duì)肝功能的影響：使其合成蛋白能力下降、合成IGF-1不足、增加其多種激素代謝酶的活性；⑥對(duì)營(yíng)養(yǎng)的影響。出現(xiàn)不同部位、不同程度的骨骼肌肉或關(guān)節(jié)疼痛、大多數(shù)伴有乏力、軀體各方向活動(dòng)受限或雙下肢抽筋等是AOP主要的臨床表現(xiàn)，但多無(wú)關(guān)節(jié)的紅腫、變形[6-7]。AOP在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中并無(wú)此病名，應(yīng)屬于中醫(yī)學(xué)中“骨痿” “骨枯” “骨極”等病的范疇[8-10]。此病多為患者素體腎氣虧虛，偏嗜飲酒發(fā)為本病。酒乃熟谷之液、水谷之精。偏嗜飲酒，酒邪乃濕熱之邪，易損傷中焦脾胃。中焦失于運(yùn)化，濕熱內(nèi)生，蘊(yùn)久化火，火曰炎上，可導(dǎo)致上焦心肝火旺。久則傷腎，使腎氣陰虧虛，氣機(jī)不暢，血行失運(yùn)，血受熱煎則為瘀[10]。血瘀而四肢百骸失于濡養(yǎng)，瘀久化熱熏灼骨髓，則骨枯髓減，發(fā)為骨痿[11-12]。酒精在體內(nèi)影響氣血精液、臟腑經(jīng)絡(luò)的生理功能，使肝脾腎俱損，筋肉骨骼失于濡養(yǎng)。故AOP病位在骨，與肝腎脾等臟生理功能失調(diào)密切相關(guān)。其病因包括內(nèi)因和外因，內(nèi)因?yàn)樗伢w腎氣虧虛，外因?yàn)檫^(guò)量飲酒。其主要病機(jī)為腎虛血瘀、氣陰虧虛[13]。

3.2 生髓健骨膠囊對(duì)BMD、BMC的影響

生髓健骨膠囊為臨床治療AOP的經(jīng)驗(yàn)方[14,18]，具有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血通絡(luò)的作用，正適合AOP的病因病機(jī)。現(xiàn)代研究表明方中鹿角膠、龜板、龍骨、牡蠣富含多種微量元素、氨基酸等，是骨組織合成所必需的物質(zhì)；用中藥葛根解酒已有千年歷史，而且葛根素能夠抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，保持其成骨分化的能力[15]；黃芪、丹參、當(dāng)歸具有抑制血小板聚集并改善微循環(huán)的作用；白術(shù)、熟地能提高機(jī)體清除自由基的能力；郁金能減輕高血脂，對(duì)肝有保護(hù)作用；牛膝用于活血通經(jīng)以鎮(zhèn)痛，可增大骨小梁密度，減小骨髓腔面積。前期研究證實(shí)[16]其能下調(diào)骨組織中PPARγ2mRNA基因的表達(dá)，抑制MSCs的成脂分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，防治骨量丟失。上調(diào)AOP大鼠小腸粘膜VDRmRNA的表達(dá)[17]，促進(jìn)腸鈣、磷的吸收，維持鈣、磷的平衡；補(bǔ)腎健脾益氣法可以提高AOP大鼠BMD和BMC含量，能夠抑制骨礦物質(zhì)丟失[18]，明顯改善AOP大鼠的癥狀，但其確切作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組BMD、BMC顯著降低，通過(guò)中藥或西藥干預(yù)后BMD、BMC均有不同程度的升高，且中藥干預(yù)組的療效優(yōu)于西藥對(duì)照組。本研究表明生髓健骨膠囊可以提高AOP大鼠BMD，增加BMC，抑制骨礦物質(zhì)的丟失，增強(qiáng)骨的強(qiáng)度，從而預(yù)防骨折的發(fā)生，值得臨床借鑒應(yīng)用。