倪利華 宋凱云 朱冬冬 王立婷 張玉霞 汪曉晨 劉必成 湯日寧*

1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院溧水分院腎內(nèi)科，江蘇 南京 210009 2.上海長海醫(yī)院，上海 200000

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是全身系統(tǒng)性疾病，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2014年全球糖尿病患者已達(dá)3.8億，其中80%在發(fā)展中國家，中國位列第一[1]。骨質(zhì)疏松癥是DM的常見并發(fā)癥，表現(xiàn)為骨量減少，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，影響骨的修復(fù)和再生[2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DM患者骨折風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病人群顯著增加，尤其1型糖尿病患者髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)是正常人群的10倍[3-4]。因此，深入探討DM骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制，對于積極防治DM骨折等并發(fā)癥具有十分重要的意義。越來越多證據(jù)表明骨髓脂肪組織在DM骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[5-7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，一定條件下內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)可發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)，可進(jìn)一步分化為脂肪細(xì)胞，即內(nèi)皮-脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[8]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，高糖能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT[9-11]。因此，本研究擬通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討高糖能否刺激ECs發(fā)生EndMT并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，參與DM骨質(zhì)疏松的形成和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及材料

1.1.1動(dòng)物：8周齡SPF級SD雄性大鼠，體重180～220 g，購于上海萊斯克公司。

1.1.2細(xì)胞：原代人主動(dòng)脈ECs(美國ScienCell公司)。

1.1.3材料：內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)；誘導(dǎo)成脂細(xì)胞培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)；葡萄糖(美國sigma公司)；油紅O工作液(中國武漢塞維爾生物公司)；CD31抗體(sc-376764，美國Santa Cruz公司)；FSP1抗體(ab-197896，美國Abcam公司)；PPAR-γ抗體(ab-209350，美國Abcam公司)；光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；micro-CT(德國Bruker公司)；雙能X線骨密度檢測儀(美國HOLOGIC公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型制備：SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食12 h，鏈脲佐菌素58 mg/kg一次性腹腔注射制備DM模型，72 h后尾靜脈采血測定血糖，血糖>16.7 mmol/L為造模成功。隨機(jī)分為2組：對照組(control，CTL)和糖尿病組(DM)，各10只。繼續(xù)喂養(yǎng)24周后處死大鼠，留取血尿、骨骼樣本。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組：ECs置于含10%FBS和1%青鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇第2～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用高糖(high glucose，HG，30 mmol/L)或正常糖(normal glucose，NG，5.5 mmol/L)干預(yù)ECs 48 h，繼而更換培養(yǎng)基為誘導(dǎo)成脂分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1周。

1.2.3骨組織HE染色、免疫熒光：分離各組大鼠左側(cè)股骨，于4%多聚甲醛中固定48 h、10% EDTA脫鈣、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，貼附于載玻片上，HE染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞(空泡結(jié)構(gòu))的數(shù)量；將3 μm股骨石蠟切片脫蠟、水化、抗normal glucose，原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(福州邁新)阻斷，加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜。次日加入相應(yīng)熒光二抗(避光，室溫孵育2 h)，DAPI染細(xì)胞核5 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察各蛋白的表達(dá)。

1.2.4Western印跡檢測：取骨骼及細(xì)胞組織，加適量裂解液勻漿，離心取上清液，提取蛋白，BCA檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白變性后SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)入PVDF膜，5% BSA封閉1 h后加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜。次日洗膜后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。

1.2.5油紅O染色：4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，水洗后加入油紅O工作液5 min，水洗后蘇木素染細(xì)胞核1 min，水洗后盡快光鏡下觀察，拍照。

1.2.6雙能X線檢測：雙能X線骨密度檢測各組大鼠腰椎和股骨的骨密度。使用雙能X線骨密度儀(檢測地址為南京中大醫(yī)院影像科)進(jìn)行骨掃描，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析骨密度。

1.2.7micro-CT檢測：使用micro-CT對大鼠股骨進(jìn)行掃描(檢測地址為南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地)。掃描結(jié)束后將原始掃描圖像導(dǎo)入microCT系統(tǒng)自帶的NRecon重建軟件中，對重建圖像進(jìn)行分析，使用CtAnalyser(SkyScan 軟件)分析骨相關(guān)參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、生化參數(shù)等變化

DM組與CTL組相比，血糖、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白升高，體重降低，P值均 < 0.05；兩組大鼠血鈣和血磷未見明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的一般資料Table 1 The general parameters of rats in each group

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 各組大鼠骨骼參數(shù)變化

雙能X線骨密度檢測示，DM組大鼠腰椎和股骨骨密度均低于CTL組(P<0.05)。見表2。股骨micro-CT掃描示，DM組遠(yuǎn)端股骨骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)目減少，骨小梁離散度增加(P<0.05)；股骨干皮質(zhì)骨厚度、皮質(zhì)骨面積無明顯改變(P>0.05)。見表3。

表2各組大鼠的骨密度檢測(g/cm2)

Table2Bone mineral density tests of rats in each group(g/cm2)

組別股骨骨密度腰椎骨密度對照組(n=8)0.278±0.0240.351±0.035糖尿病組(n=6)0.230±0.026*0.270±0.042*

注：與對照組相比，*P<0.05。

表3 各組大鼠的micro-CT檢測Table 3 Micro-CT analysis of rats in each group

注：與對照組相比，*P<0.05。

圖1 各組大鼠脛骨HE染色及脂肪含量分析(HE染色的骨髓空泡結(jié)構(gòu)為脂肪細(xì)胞)Fig.1 HE staining of the tibias and quantification of the bone fat(bone marrow vacuoles with H&E stain indicated adipocytes)

2.3 各組大鼠骨髓脂肪組織變化

骨組織HE染色時(shí)骨髓空泡結(jié)構(gòu)示脂肪細(xì)胞。如圖1所示，DM組大鼠骨髓腔內(nèi)充滿脂肪細(xì)胞，其脂肪組織含量較CTL組顯著增多(P<0.05)。

2.4 各組大鼠骨髓ECs EndMT的影響

以內(nèi)皮標(biāo)記物CD31和間充質(zhì)標(biāo)志物FSP1作為檢測EndMT的指標(biāo)。Western印跡示，與CTL組相比，DM組CD31表達(dá)減少，F(xiàn)SP1表達(dá)增多(P>0.05)；骨組織熒光結(jié)果示，DM組骨髓CD31和FSP1存在表達(dá)重疊。見圖2。

圖2 各組大鼠骨髓CD31和FSP1的表達(dá)情況 A：大鼠骨組織共聚焦顯微鏡檢測免疫熒光，白色箭示骨髓CD31和FSP1存在共表達(dá)情況；B～D：CD31和FSP1蛋白的表達(dá)(Western印跡)。Fig.2 The protein expression of bone marrow CD31 and FSP1 of rats in each group. A: Immunofluorescence was detected by confocal microscopy in rat bone tissues. White arrow showed co-expression of CD31 and FSP1 in bone marrow. B-D: The protein expression of CD31 and FSP1 (Western blotting).

2.5 體外高糖干預(yù)對ECs EndMT的影響

NG(5.5 mmol/L)和HG(30 mmol/L)分別干預(yù)ECs 48 h。Western印跡示，與NG組相比，HG組CD31蛋白表達(dá)減少，F(xiàn)SP1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果示，HG組細(xì)胞CD31表達(dá)減少，并獲得性表達(dá)FSP1。見圖3。

2.6 體外高糖干預(yù)可促進(jìn)ECs進(jìn)一部分化為脂肪細(xì)胞

ECs分別給予NG或HG干預(yù)48 h，繼而使用脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化1周。Western印跡結(jié)果示，HG組脂肪細(xì)胞標(biāo)志物PPAR-γ蛋白表達(dá)顯著高于NG組(P<0.05)，油紅O染色陽性，見圖4。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，異常升高的血糖水平是DM骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，降低血糖治療能顯著改善患者骨代謝情況[12]。DM往往伴隨一定程度的骨質(zhì)疏松，制約患者的生活質(zhì)量，但是潛在機(jī)制仍不十分清楚。

既往人們普遍認(rèn)為，DM骨質(zhì)疏松與高糖、氧化應(yīng)激、晚期糖基化產(chǎn)物形成、炎癥因子釋放等有關(guān)[6]。近年來研究表明，骨髓脂肪組織參與了DM骨質(zhì)疏松的形成和發(fā)展[5-7]。異常增多的骨髓脂肪細(xì)胞能引起骨質(zhì)疏松，可能與以下3個(gè)方面有關(guān)[13]：(1)骨髓脂肪細(xì)胞能分泌一些細(xì)胞因子，影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能；(2)骨髓脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞均主要來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪細(xì)胞的增多必然導(dǎo)致骨髓成骨細(xì)胞合成減少；(3)脂肪因子(如瘦素、脂聯(lián)素等)通過交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控骨的形成。研究證實(shí)[14-15]，減少骨髓脂肪組織合成的靶向治療能促進(jìn)骨形成。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于CTL組，DM組大鼠存在明顯的骨質(zhì)疏松，并伴隨骨髓脂肪細(xì)胞顯著增多。故探討異常增多的骨髓脂肪細(xì)胞來源成為深入理解DM骨質(zhì)疏松機(jī)制的關(guān)鍵。

目前，關(guān)于骨髓脂肪組織來源的研究主要集中在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[16]。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞一定條件下也能轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，成為骨髓脂肪細(xì)胞的重要來源[8]。2010年，Medici等[8]使用BMP-2和BMP-4干預(yù)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，且獲得間充質(zhì)干細(xì)胞特性，繼而在脂肪誘導(dǎo)環(huán)境下表達(dá)脂肪細(xì)胞表型。這提示ECs可能通過EndMT形成脂肪細(xì)胞，直接參與了骨質(zhì)疏松的過程。其后Horwits等[17]也指出ALK2能刺激ECs發(fā)生EndMT，可進(jìn)一步誘導(dǎo)形成軟骨和成骨細(xì)胞，參與骨再生和重建。Lin等[18]發(fā)現(xiàn)BMP4能促進(jìn)內(nèi)皮-成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，參與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。筆者前期研究[9]發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)ECs發(fā)生EndMT，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31表達(dá)減少，間充質(zhì)標(biāo)志物FSP1表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠較CTL組骨髓CD31蛋白表達(dá)減少，F(xiàn)SP1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；骨組織熒光可見DM組骨髓CD31和FSP1表達(dá)重疊，這些均提示DM大鼠骨髓EndMT的發(fā)生；進(jìn)一步體外高糖干預(yù)ECs 48 h，與NG組相比，HG組CD31蛋白表達(dá)減少，F(xiàn)SP1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；對高糖刺激的ECs誘導(dǎo)成脂分化1周發(fā)現(xiàn)，HG組細(xì)胞脂肪細(xì)胞標(biāo)志物PPAR-γ蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，油紅O染色陽性，以上提示發(fā)生EndMT的ECs能夠進(jìn)一步分化為脂肪細(xì)胞(內(nèi)皮-脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化)，促進(jìn)脂肪樣細(xì)胞在骨髓堆積，介導(dǎo)DM骨質(zhì)疏松。

圖3 高糖干預(yù)ECs的CD31、FSP1蛋白表達(dá)變化 A～C：CD31和FSP1蛋白的表達(dá)(Western 印跡)；D：細(xì)胞共聚焦免疫熒光雙染(1000倍)Fig.3 The protein expression of CD31 and FSP1 in cultured ECs after high glucose stimulation. A-C: CD31 and FSP1 protein expression (Western blotting); D: immunoflurescence double staining observed with confocal scanning microscope (1000 times).

圖4 經(jīng)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后ECs向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 A、B：PPAR-γ蛋白的表達(dá)(Western印跡)；C：細(xì)胞油紅O染色(200倍)Fig.4 The ECs were transformed into adipocytes after cultured in adipogenic medium for one week. A, B：Expression of PPAR-γ protein (Western blotting); C: Oil red O staining (200 times).

總而言之，本研究結(jié)果證實(shí)，高糖可誘導(dǎo)ECs發(fā)生EndMT，可進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞(內(nèi)皮-脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化)，參與DM骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。