單壹壹 申琳 李丹丹 于晶

摘 要： 選用簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）分子標記，對分布于浙江清涼峰國家級自然保護區(qū)順溪塢和涼源、浙江臺州臨海天臺山、浙江舟山嵊泗列島、江蘇蘇州天平山、廣西上思十萬大山、臺灣宜蘭縣馬告生態(tài)公園和云南西雙版納納板河流域國家自然保護區(qū)8個自然居群的40份節(jié)莖曲柄蘚（Campylopus umbellatus （Arn.） Par.）的遺傳多樣性進行了研究.應用篩選出的12條引物，共擴增出172條清晰、重復性高的條帶.使用POPGENE 3.2分析發(fā)現：其中158條條帶的多態(tài)性位點百分率（PPB）為91.86%，根井正利基因多樣性指數（H）為0.2922，香農-維納多樣性指數（I）為0.4459，說明節(jié)莖曲柄蘚居群遺傳多樣性水平較高.8個居群的遺傳分化系數（Gst）為0.6346，居群間的基因流（Nm）為0.2879，63.33%的遺傳變異存在于居群間，36.67%的遺傳變異存在于居群內，說明節(jié)莖曲柄蘚居群間的遺傳分化明顯.基于ISSR數據的聚類分析表明：以遺傳距離65為分組閾值，8個居群可被分為6組，節(jié)莖曲柄蘚居群間的遺傳分化主要由地理因素造成，居群內的遺傳分化可能與生境的異質性有關.

關鍵詞： 節(jié)莖曲柄蘚; 簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）; 遺傳多樣性

中圖分類號： Q 948文獻標志碼： A文章編號： 1000-5137（2019）02-0207-10

0 引 言

在分子水平上，對于苔蘚植物的遺傳研究一般運用分子標記法[1].目前，DNA分子標記技術已發(fā)展出10余種，常用手段包括隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）、簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）等[1-2].ISSR是由加拿大ZIETKIEWICZ等[3]提出的，以錨定的微衛(wèi)星為引物，擴增間隔較小的兩個簡單序列長度多態(tài)性（SSR）間的序列，再通過凝膠電泳條帶分析樣本DNA多態(tài)性的方法[2].其優(yōu)點是無需預先知道基因組的任何信息就可以進行標記，可以在生長周期的任何階段進行檢測，而且引物設計容易，成本低，DNA用量少[1-2，4]，被認為是一種非常理想的分子標記方法.ISSR分子標記技術已被廣泛應用于許多被子植物[2，5-7]的遺傳多樣性分析中，但對于苔蘚植物，如：黃絲瓜蘚（Pohlia nutans （Hedw.） Lindb.）[8]、鼠尾蘚（Myuroclada maximowiczii （G.G.Borshch.） Steere & W.B.Schofield）[9]、小羽蘚屬（Haplocladium （Müll.Hal.） Müll.Hal.）[10]和中華蓑蘚（Macromitrium cavaleriei Cardot & Thér.）[11]的遺傳多樣性的研究，常使用的是RAPD標記法.汪琛穎等[12]對狹邊大葉蘚（Rhodobryum ontariense （Kindb.） Paris）[4]和真蘚科（Bryaceae Schwgr.），王瑩瑩[13]對浙江千島湖大灰蘚（Hypnum plumiforme Wilson）和東亞小金發(fā)蘚（Pogonatum inflexum （Lindb.） Sande Lac.），買買提明·蘇來曼等[14]對水蘚科（Fontinalaceae Schimp.），魏青永等[15]對卷葉鳳尾蘚（Fissidens dubius P.Beauv.）使用ISSR標記法進行了遺傳多樣性的研究.

曲尾蘚科（Dicranaceae）的曲柄蘚屬（Campylopus Brid.）是泛熱帶分布的類群[16].自BRIDEL[16]基于Campylopus flexosus （Hedw.） Brid.創(chuàng)立曲柄蘚屬以來，該屬植物先后被報道多達1480 種，目前接受的種名有160種左右[17].

中國曲柄蘚屬植物目前被接受的有20余種[18-21].其中，節(jié)莖曲柄蘚（Campylopus umbellatus （Arn.） Paris）分布于中國十幾個省.該種植物體形態(tài)、大小以及不同部位葉片特征變化很大，毛尖有無、毛尖長度、莖長度以及葉片和中肋寬度的比值等都會有強烈變異[21].其典型特點是：植物體中等至大型，粗壯，墨綠色或黃綠色，常具透明長毛尖，葉基部寬，具明顯角細胞，不突出或略突出，中肋占葉片基部1/3～1/2，中肋背部有2～4個細胞高的櫛片，葉片中上部細胞為紡錘形至短蟲形.BROTHERUS[22]把葉片無透明毛尖和透明毛尖短的類型歸類為C.sinensis （Müll.Hal.） J.-P.Frahm;DUBY[23]把葉片有毛尖、透明毛尖短、中肋上部櫛片低的類型歸類為C.nigrescens （Mitt.） Duby.DIXION[23]根據該種植物體與C.coreensis Cardot相似，因其葉片稍長、葉寬、中肋背面櫛片稍高等，將其歸類為一個變種C.coreensis Card.var.amoyensis Dixon & Thér;高謙[21]認為以上各類型均屬本種特點范疇，故都擬為本種異名，并且認為本種并非中美洲和南美洲產的C.richardii Brid..FRAHM[14]在對東亞曲柄蘚屬植物進行修訂時，列出了該種的12個異名，其中包括了C.coreensis Cardot.由密蘇里植物園主辦的Tropics（http：//www.tropicos.org/）網站收錄的該種異名達38個.

FRAHM[16]認為C.umbellatus （Arn.） Paris植物的大小在其分布范圍內，從內部到邊緣呈梯度變化，在東南亞和中國南部高達幾厘米，但在北部僅1 cm左右.為了解這些形態(tài)變異是否有遺傳基礎，本文作者基于ISSR技術，對該種的8個地理居群進行了遺傳多樣性分析.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗對象為采自浙江、江蘇、廣西、云南和臺灣的節(jié)莖曲柄蘚8個居群40份樣品，具體采集信息見表1.為確保采集的樣品是不同克隆的植株，每個居群采樣間距最小為5 m [14].樣品采集后裝于牛皮紙標本袋中，自然風干后冷凍保存?zhèn)溆?實驗所涉及的憑證標本保存于上海師范大學（SHNU）苔蘚植物標本館.

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP305）;Es Taq MasterMix（康為世紀生物科技有限公司，CW0690）;所有引物均由上海生物工程有限公司合成并提供.

1.3 DNA提取及聚合酶鏈式反應（PCR）擴增

選取40份節(jié)莖曲柄蘚的新鮮植物體莖尖，無菌水沖洗干凈并用變色硅膠粒干燥后，分別用試劑盒提取基因組DNA，制成DNA樣品，-20℃保存?zhèn)溆?從加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR通用引物中，參考文獻[2]選取退火溫度為50～55 ℃之間的56條引物進行篩選，篩出的12條引物見表2;采用康為公司提供的Es Taq MasterMix 50 μL反應體系進行PCR擴增，擴增程序參考汪琛穎等[4]對狹邊大葉蘚遺傳多樣性ISSR分析的擴增程序;PCR擴增產物在含溴化乙錠（EB）核酸染料的質量濃度為20 g·mL-1的瓊脂糖凝膠電泳中分離，電壓為80 V;應用全自動數碼凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon 2500）對電泳結果進行觀察并拍照記錄.

1.4 數據記錄與分析

將實驗得到的凝膠電泳圖中的每一個條帶均視為一個分子標記，統(tǒng)計電泳圖譜是否有處于同一位置的DNA帶，有的記為“1”，無帶的記為“0”，得到一個0/1二元數據矩陣[4].采用POPGENE 3.2分析軟件對節(jié)莖曲柄蘚所有居群進行遺傳多樣性參數分析[4]，分別計算多態(tài)性位點百分率（PPB）、根井正利基因多樣性指數（H）、香農-維納多樣性指數（I）等遺傳多樣性參數以及各居群間的遺傳分化系數和基因流等遺傳分化指數，并分別計算12條引物的PPB.運用PCORD 4.0軟件，根據40份樣品的遺傳距離構建反映各居群遺傳關系的聚類圖，以研究各居群間遺傳變異與地理距離的相關性[2，4].

2 結果與分析

2.1 節(jié)莖曲柄蘚ISSR擴增結果

利用篩選出擴增條帶清晰、重復性好的12條引物，對8個居群40份節(jié)莖曲柄蘚樣品進行PCR擴增，共得到172個擴增位點，其中158個為多態(tài)性位點，PPB達91.86%，表明8個居群的40份節(jié)莖曲柄蘚樣品在分子水平上具有豐富的多態(tài)性，遺傳基礎較廣.12個引物擴增出的條帶大小多集中在300～2500 bp之間.由表2可知，平均每個引物擴增出位點14.33個，多態(tài)性位點13.17個.擴增位點最多的是UBC841，共擴增出19個位點;引物UBC808，UBC880次之，分別為18個;最少的是UBC825和UBC827，只有9個.引物多態(tài)性位點百分率最高的是UBC825，UBC827和UBC842，可達100%.引物UBC826的PPB最低，但也達81.82%，說明引物UBC825，UBC827和UBC842對于節(jié)莖曲柄蘚這8個居群遺傳多樣性的研究效果最好.本實驗篩選出的12條ISSR引物，堿基A含量都非常豐富，其中5條含有豐富的堿基C，另外8條富含堿基G.

2.2 居群的遺傳多樣性分析

多樣性指數通常用于表示居群內和居群間的遺傳變異程度[11].基于ISSR標記的節(jié)莖曲柄蘚的遺傳多樣性指數如表3所示.由表3可知：8個居群的PPB變化范圍為9.30%～36.05%，PPB最高的居群是云南西雙版納納板河居群，為36.05%;廣西上思十萬大山居群和浙江省清涼峰保護區(qū)的順溪塢居群次之，都為35.47%;接著依次是浙江舟山嵊泗列島居群、臺灣宜蘭縣馬告生態(tài)公園居群、浙江臺州臨海天臺山居群和江蘇蘇州天平山居群，分別為34.30%，30.23%，29.07%和13.95%;多態(tài)性位點百分率最低的是浙江清涼峰保護區(qū)涼源居群，僅為9.30%;各居群內平均PPB為27.98%，物種水平上居群總的PPB為91.86%.

I的變化范圍為0.0576～0.2210（表3），表明不同地理來源的節(jié)莖曲柄蘚居群內的遺傳多樣性存在一定差異，其中I最高的是云南西雙版納納板河居群，接著依次是十萬大山居群、嵊泗列島居群、順溪塢居群、馬告生態(tài)公園居群、天臺山居群和天平山居群，最低的是涼源居群.各個居群內平均I為0.1635，物種水平上居群總的I為0.4459.

節(jié)莖曲柄蘚居群的H的變化范圍為0.0400～0.1526（表3），其中H最高的是云南西雙版納納板河居群，接著依次是十萬大山居群、嵊泗列島居群、順溪塢居群、天臺山居群、馬告生態(tài)公園居群和天平山居群，最低的是涼源居群.各個居群內H的平均值為0.1114，物種水平上居群總的H為0.2922.

由表3還可知，各居群的PPB，I和H比較一致，云南西雙版納納板河、廣西上思十萬大山、浙江舟山嵊泗列島和浙江清涼峰順溪塢居群的遺傳多樣性指數比浙江臺州臨海天臺山、臺灣宜蘭縣馬告生態(tài)公園、江蘇蘇州天平山和浙江清涼峰涼源居群的高.僅在個別居群之間，3個參數略有差異，如I和H反映嵊泗列島居群的遺傳多樣性高于順溪塢居群，而PPB反映的結果則相反;PPB和I反映馬告生態(tài)公園居群的遺傳多樣性高于天臺山居群，而H反映的結果則相反.

2.3 居群的遺傳分化分析

H是衡量居群遺傳分化的最常用指標，常用來計算總的遺傳變異中，居群間變異所占的比例[10].表4顯示：由I估算的總遺傳變異中，63.33%的遺傳變異存在于居群間，36.67%存在于居群內;由H估算的遺傳分化系數表明總遺傳變異中，61.88%的遺傳變異存在于居群間，38.12%存在于居群內.I和H估算的結果一致，均表明節(jié)莖曲柄蘚的遺傳變異大部分存在于居群間.同時，居群的基因流較小，僅為0.2879，說明居群間的基因流動水平低，居群之間的遺傳隔離明顯，不同的居群通過遺傳變異以適應不同的環(huán)境，但是基因交流較少.

2.4 居群的遺傳距離和聚類分析

基于ISSR標記的8個節(jié)莖曲柄蘚居群的遺傳距離和遺傳相似系數見表5，節(jié)莖曲柄蘚8個居群間遺傳相似系數在0.6408～0.8766之間變化，平均值為0.7517，說明節(jié)莖曲柄蘚8個居群間的遺傳相似性較小，居群間的遺傳分化明顯，這與2.3節(jié)的結果一致;其中浙江清涼峰保護區(qū)順溪塢居群和浙江臺州臨海天臺山居群遺傳相似系數最高，為0.8766，其次是順溪塢居群和涼源居群，遺傳相似系數為0.8587，江蘇蘇州天平山居群和浙江清涼峰保護區(qū)涼源居群的遺傳相似系數相對較小，為0.6408;8個居群的遺傳距離在0.1317～0.4451之間變化，平均值為0.2895.

基于ISSR標記，應用POPGENE 3.2軟件，根據遺傳距離作出8個居群40個樣品的遺傳關系聚類圖（圖1）.以遺傳距離65為分組閾值，由圖1可知，這8個居群可以分為6組，分別是浙江清涼峰保護區(qū)的順溪塢居群、涼源居群和浙江臺州臨海天臺山居群聚集成的一組，剩下的5個居群（臺灣宜蘭馬告生態(tài)公園居群、浙江舟山嵊泗列島居群、江蘇蘇州天平山居群、云南納板河居群、廣西上思十萬大山居群）分別自成一組.這8個居群主要分成兩個大的分支：分支①由順溪塢居群、涼源居群、臺州天臺山居群、臺灣宜蘭居群及舟山嵊泗列島居群組成;分支②由江蘇天平山居群、云南納板河居群和廣西十萬大山居群聚集形成.分支①又由2個小的分支組成：同屬于浙江省的順溪塢居群、涼源居群和臺州天臺山居群聚為一個小分支;同屬于島嶼氣候的舟山嵊泗列島居群和臺灣宜蘭居群聚集為另一個小分支.分支②中江蘇天平山居群先和云南納板河居群聚集再與廣西十萬大山居群聚集.研究結果顯示：節(jié)莖曲柄蘚的遺傳變異與地理位置及生境氣候相關.

基于節(jié)莖曲柄蘚40個樣品，8個居群的形態(tài)特征數據，即ISSR電泳位點和8個居群分布的地理信息數據，應用R語言程序計算得到該種40個樣品的形態(tài)特征與ISSR數據相關性分析圖（圖2）.由圖2可知，該種40個樣品的形態(tài)分化與其地理分布的相關性系數R為0.607，在P<0.05的水平上達到顯著相關.

3 討 論

3.1 節(jié)莖曲柄蘚的遺傳多樣性

在種水平上，應用12個引物對節(jié)莖曲柄蘚8個居群40個樣品進行了ISSR分析，共擴增出172條清晰、重復性高的條帶，POPGENE 3.2分析結果表明：有158個為多態(tài)性位點，PPB為91.86%;I為0.4459，居群內平均值為0.1635;H為0.2922，居群內平均值為0.1114.郭水良等[11]基于RAPD數據探討了中華蓑蘚4個居群的遺傳變異基礎，中華蓑蘚的PPB為79.96%，物種水平的I為0.5126，4個居群的平均值為0.4055，總的H為0.3307，4個居群的平均值為0.2755，認為中華蓑蘚的遺傳變異主要存在于居群之內.劉麗等[9]也應用RAPD分子標記對鼠尾蘚8個居群的遺傳多樣性進行了研究，得到其PPB為84.60%，I為0.4877，H為0.3326，居群內平均值為0.2228;李倩影[10]研究了小羽蘚屬遺傳多樣性，在104個檢測位點中發(fā)現94個多態(tài)性位點，PPB為91.35%，總居群的H為0.2682，I為0.4108，該種居群表現出較高的遺傳多樣性，總的遺傳居群間遺傳分化系數為0.5591，居群內遺傳分化系數為0.1182，居群間的變異程度遠遠大于居群內的變異程度;汪琛穎等[4]對9個狹邊大葉蘚居群的遺傳多樣性進行了ISSR分析，PPB為37.75%，H為0.1530，I為0.2228，遺傳分化指數為0.2997，遺傳變異主要存在于居群內，認為該種的居群遺傳距離和地理距離沒有相關性.比較發(fā)現，節(jié)莖曲柄蘚的遺傳多樣性與鼠尾蘚和小羽蘚屬相近，而高于狹邊大葉蘚，低于中華蓑蘚.可能是因為在野外，很少見有節(jié)莖曲柄蘚的孢子體，說明該種有性繁殖能力弱，配子體主要通過營養(yǎng)繁殖擴展種群，這種繁殖方式使其遺傳多樣性主要存在于居群之間.

3.2 節(jié)莖曲柄蘚的遺傳結構與分化

從聚類分析圖（圖1）可看出：節(jié)莖曲柄蘚的40個樣本8個居群以遺傳距離65為分組閾值可以分為6組，同屬于浙江省的順溪塢居群、涼源居群以及臺州臨海天臺山居群聚集為一組，說明這3個居群的遺傳相似性高，遺傳距離近，這個結論與其相近的地理位置關系是吻合的;剩下的5個居群（臺灣宜蘭居群、浙江舟山嵊泗列島居群、江蘇天平山居群、云南納板河居群、廣西十萬大山居群）各自分別形成5組，這5個居群的遺傳相似性低，遺傳距離遠，這與其所處的空間距離較遠吻合;聚類圖中分支②是由江蘇天平山居群、云南納板河居群、廣西十萬大山居群聚集形成，云南納板河居群和廣西十萬大山居群所處的地理位置毗鄰且處于同一緯度，而這兩個居群與江蘇天平山居群的氣候特點相似，說明空間距離相近的居群，或者生長環(huán)境相近的居群遺傳相似度高.分支①中：雖然舟山嵊泗列島也屬于浙江省，但其同臺灣宜蘭居群先聚集在一起，最終才與浙江省另外3個居群形成的分支聚集在一起，這是由于這兩個地區(qū)都屬于島嶼氣候.說明節(jié)莖曲柄蘚的遺傳變異受地理生境和環(huán)境氣候影響大，這8個居群的基因流動水平較低，居群間遺傳分化明顯，這與居群所處環(huán)境的異質性有關.同時，形態(tài)特征與ISSR數據相關性分析圖（圖2）反映出該種40個樣品的形態(tài)分化與其地理分布的相關性指數為0.607，在P<0.05的水平上達到顯著相關，也證明了節(jié)莖曲柄蘚8個居群間的遺傳分化與所處環(huán)境的異質性有關.

WRIGHT[25]認為，居群間基因流大于1時，則能發(fā)揮其均質化作用，反之若基因流小于1時，則表明基因流是造成遺傳分化的主要因素，不同的基因型在不同的微生境上的適合度不同，導致具有相同基因型的個體聚集在相似的微生境上，從而產生居群間的遺傳分化.本研究中，節(jié)莖曲柄蘚居群的基因流為0.2879，遺傳分化系數為0.6346，說明節(jié)莖曲柄蘚居群間雖然有一定的基因流動，但是流動水平較低，且主要存在于生境相似的居群間，而在居群內部，由于居群生境連續(xù)性差，像江蘇的天平山、清涼峰保護區(qū)的涼源，發(fā)生大量的遺傳漂變[4]，從而導致該種植物遺傳變異的產生.

3.3 島嶼生境的節(jié)莖曲柄蘚居群的遺傳多樣性分析

由于島嶼的特殊環(huán)境，關于其苔蘚植物的遺傳多樣性研究較少.沿海島嶼，由于長期處于隔離狀態(tài)下，并且相當一部分苔蘚植物又很少產生孢子，無法基于孢子進行遠距離傳播，因而產生基因流減弱，苔蘚植物遺傳漂變等[26].WANG等[27]研究發(fā)現：千島湖區(qū)破碎化的生境中，以無性繁殖為主的大灰蘚（Hypnum plumiforme Wilson），其島嶼居群的遺傳多樣性顯著高于湖邊居群，而經常以有性繁殖為主的東亞小金發(fā)蘚（Pogonatum inflexum （Lindb.） Lac.），其島嶼群落和湖邊群落的遺傳分化程度不高.

本研究中采自舟山嵊泗列島的節(jié)莖曲柄蘚居群，其位于長江口與杭州灣的交匯處，在浙江省最東部、舟山群島最北部，處于華南褶皺系的次級構造單元新昌—定?！B山斷隆的東北部邊緣，是浙東天臺山脈向東北延伸沉陷入海的外露部分[26].從表5可知，舟山嵊泗列島居群與臺州天臺山居群的遺傳相似性系數最高，其次是與同樣位于浙江的順溪塢和涼源居群.聚類分析圖（圖1）也顯示：舟山嵊泗列島節(jié)莖曲柄蘚居群最后與浙江順溪塢和涼源居群聚類在一起，說明節(jié)莖曲柄蘚居群遺傳距離和地理距離有相關性.多態(tài)性位點百分率、根井正利基因多樣性指數和香濃-維納多樣性指數（表3）分析表明：舟山嵊泗列島節(jié)莖曲柄蘚居群的遺傳多樣性又高于浙江臺州天臺山居群.這與WANG等[27]對千島湖區(qū)大灰蘚居群遺傳多樣性的研究結果相符，說明島嶼生境的長期隔離使苔蘚植物發(fā)生遺傳漂變，這也印證了HUTSEMKERS等[28]的觀點：海洋島嶼不是孢子植物遺傳多樣性的“洼地”，也不是進化上的死胡同.

本研究中采自舟山嵊泗列島的節(jié)莖曲柄蘚居群與采自臺灣的居群聚類在一起，這是由島嶼環(huán)境的特殊性導致的.嵊泗列島屬亞熱帶海洋性季風氣候，冬無畏寒，夏無酷暑，常年溫和濕潤，四季分明[29];臺灣是位于亞洲東部、太平洋西北側的島嶼，北回歸線將其劃為南北兩個氣候區(qū)，北部屬亞熱帶季風氣候，南部則為熱帶季風氣候，因其四面環(huán)海，氣候又受海洋性季風調節(jié).本研究所用樣品采自臺灣最北端的宜蘭縣馬告生態(tài)公園明池森林游樂區(qū)，氣候特點與嵊泗列島相似，且經度相近，故節(jié)莖曲柄蘚在這兩個地區(qū)的居群遺傳距離相近，在聚類圖上聚集在一起.

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（責任編輯：顧浩然）