魯凱珩 金清 曹沁 李珊珊 孫舒榮 蔣秋艷 金杰人 凌麗晨 符歆灝 杜萱 肖明

摘 要： 對(duì)貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）S3-1與桔黃假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）JD37進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)：兩者都具有良好的促生能力.將兩者制備成相應(yīng)的液體肥料，施加于種植西紅柿的土壤中，發(fā)現(xiàn)S3-1能更顯著提升西紅柿果實(shí)中的可溶性糖、可溶性蛋白、可滴定酸、抗壞血酸的含量.對(duì)西紅柿根際土壤進(jìn)行平板涂布，發(fā)現(xiàn)S3-1能夠有效地阻擋更多微生物，尤其是細(xì)菌進(jìn)入植物的根際.使用S3-1生物肥料后，西紅柿的干重、根長(zhǎng)未見(jiàn)明顯變化.進(jìn)一步的研究顯示：S3-1生物肥料顯著降低了土壤的脲酶活性，卻對(duì)土壤蔗糖酶活性沒(méi)有太大的影響.

關(guān)鍵詞： 貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）; 桔黃假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）; 菌種性質(zhì); 果實(shí)品質(zhì); 土壤酶活性

中圖分類號(hào)： Q 93文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)： 1000-5137（2019）02-0197-10

0 引 言

西紅柿（Lycopersicon esculentum Mill.）栽培廣泛，且隨著蔬菜種植業(yè)的發(fā)展，其種植面積還在不斷擴(kuò)大，生產(chǎn)效益顯著[1-2].施用化肥能夠有效地提升西紅柿的產(chǎn)量，但是過(guò)度施用也會(huì)造成土壤的酸、堿化，破壞土壤微生物區(qū)系和自然農(nóng)業(yè)的生態(tài)系統(tǒng).微生物肥料是一種含有相應(yīng)活性微生物的生物制劑，具有無(wú)毒、無(wú)污染的特性，具有廣闊的應(yīng)用前景[3].

芽孢桿菌（Bacillus）具有良好的促生能力，可通過(guò)浸種、澆施、灌根等多種方法在多種蔬菜、果樹(shù)和作物上使用.解淀粉芽孢桿菌Sneb709能有效地促進(jìn)西紅柿果實(shí)的質(zhì)量[4];以芽孢桿菌為主要成分的仙豐168經(jīng)過(guò)200倍稀釋，能有效提升西紅柿的株高[1];解淀粉芽孢桿菌B1619則提升了西紅柿幼苗的株高、鮮重、干重等[5].但貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對(duì)于西紅柿的促生影響以及對(duì)土壤酶活性的影響還鮮有報(bào)道.

假單胞菌（Pseudomonas）是一類重要的土壤微生物，其在不同的土壤微生物群落中的占比為1%～34%，同時(shí)也是一類重要的植物根際促生菌（PGPR），常作為生防細(xì)菌以及促生細(xì)菌來(lái)使用[6-7].現(xiàn)階段假單胞菌的促生作用主要集中在小麥、蔞蒿[8]、蘑菇[9]等作物上，關(guān)于其對(duì)西紅柿的影響的研究則側(cè)重于病害防治方面，而關(guān)于其對(duì)西紅柿的促生能力的報(bào)道較少.

本實(shí)驗(yàn)研究了兩株菌株貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）S3-1與桔黃假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）JD37對(duì)于西紅柿品質(zhì)以及土壤酶活性的影響之間的差異，希望為后續(xù)的微生物肥料的制備與應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料西紅柿S18-02幼苗由上海師范大學(xué)種質(zhì)資源中心提供，貝萊斯芽孢桿菌S3-1（B.velezensis）與桔黃假單胞菌JD37（P.chlororaphis subsp.aurantiaca）由上海師范大學(xué)微生物與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏.實(shí)驗(yàn)試劑包括：鉻天青S（Chromeazurol S）固體平板，NBRIP溶磷固體培養(yǎng)基，ADF培養(yǎng)基，無(wú)菌脫脂牛奶培養(yǎng)基，salkowski試劑，Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基，Kings Medium B（KMB）液體培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基.

1.2 菌種性質(zhì)鑒定[10-11]將4 ℃下保藏在平皿中的S3-1與JD37分別接種至LB液體培養(yǎng)基與KMB液體培養(yǎng)基中，活化24 h后得到種子液.接種至新的LB與KMB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h后得到發(fā)酵液，用移液槍小心地吸取1 μL發(fā)酵液點(diǎn)于CAS固體平板、NBRIP溶磷固體培養(yǎng)基上，觀察其是否是產(chǎn)鐵載體和其溶磷的能力.將上述溶液進(jìn)行梯度稀釋后吸取100 μL均勻地涂布在ADF培養(yǎng)基（培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，無(wú)法加熱重復(fù)使用）中，若干天后觀察是否有菌落產(chǎn)生.利用salkowski法測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）的能力.

1.3 菌株生物信息學(xué)分析將S3-1和JD37分別與已有文獻(xiàn)中證明具有植物促生能力的芽孢桿菌與桔黃假單胞菌根據(jù)16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以便對(duì)其應(yīng)用潛力進(jìn)行分析.

1.4 大田實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)于2018年4月—7月開(kāi)展大田實(shí)驗(yàn).大田共分為6塊，每塊面積為1.5 m×3.5 m，縱向間隔35 cm移栽一株西紅柿幼苗，橫向間隔30 cm移栽一株西紅柿幼苗，每塊地共移栽45株幼苗，總計(jì)移栽幼苗180株（圖1）.按上文方式活化S3-1與JD37后，以1%的接種量接種于新的LB與KMB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液.空白對(duì)照使用未經(jīng)接種的LB與KMB液體培養(yǎng)基.將兩者均以1∶50的體積比加水稀釋[12].每隔7 d以灌根的方式對(duì)西紅柿進(jìn)行菌液澆灌，每天在每塊地塊定量澆水10 L以保持土壤濕潤(rùn).

1.5 西紅柿根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量及其根長(zhǎng)、株高和植株干重的測(cè)定種植前采集土壤樣品A，待到西紅柿成熟時(shí)將西紅柿植株連根拔出，收集其根系土壤B[13].將1 g土壤置于9 mL無(wú)菌水中，震蕩均勻，再取1 mL溶液至9 mL無(wú)菌水中，該過(guò)程重復(fù)3次，分別制備成體積分?jǐn)?shù)為1×10-3與1×10-4的混懸液α，β.用移液槍取100 μL混懸液β分別涂布于NB固體培養(yǎng)基與高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，計(jì)數(shù)細(xì)菌與放線菌;吸取100 μL混懸液α涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)真菌數(shù)量;待菌體形成明顯菌落后，記錄菌落數(shù)[14].

通過(guò)以下公式來(lái)觀察不同處理組西紅柿根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量的變化：其中，C為變化率，a為土壤A中的微生物數(shù)量，b為土壤B中的微生物數(shù)量.將西紅柿植株在烘箱內(nèi)以105 ℃恒溫烘干至恒重后測(cè)量其根長(zhǎng)、株高和干重.

1.6 西紅柿果實(shí)品質(zhì)的測(cè)定

采集同一批成熟的西紅柿果實(shí)，進(jìn)行勻漿后，使用手持式折光儀分別測(cè)定其可溶性固形物;用滴定法測(cè)定其可滴定酸;用二氯酚靛酚染料滴定法測(cè)定其抗壞血酸;用蒽酮法測(cè)定其可溶性糖;用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定其可溶性蛋白;用紫外分光光度法測(cè)定其硝酸鹽的含量[15].

1.7 土壤酶活性測(cè)定

對(duì)根際土壤分別測(cè)定了脲酶和蔗糖酶的酶活性[16].

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用以下軟件處理數(shù)據(jù)：SPSS 24.0，Origin 2017，MEGA7.0.21.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種性質(zhì)

圖2（a）為得到的IAA質(zhì)量濃度與535 nm波長(zhǎng)下吸光度（即光密度OD535）值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖2（b）為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的S3-1與JD37產(chǎn)IAA的量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖.由圖2可知：S3-1的IAA最高產(chǎn)量雖不如JD37，且也不能快速地產(chǎn)生IAA，但其最高產(chǎn)量（7.80 μg·mL-1）能維持2 d才出現(xiàn)緩慢下降;而JD37能快速達(dá)到其最高產(chǎn)量（8.75 μg·mL-1），但其下降也非常迅速，第3 d開(kāi)始處于較穩(wěn)定階段時(shí)其IAA產(chǎn)量已經(jīng)較低.所以S3-1相較于JD37，在產(chǎn)IAA的能力方面穩(wěn)定性更強(qiáng)，更為可靠.

S3-1與JD37都具有產(chǎn)蛋白酶的活性以及產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC）脫氨酶的活性，而S3-1具有產(chǎn)鐵載體的能力，JD37具有溶磷活性.以上性質(zhì)均是良好的植物促生細(xì)菌所具有的能力，所以適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展.

2.2 菌種生物信息學(xué)分析

通過(guò)與已知的具有植物促生能力的功能菌株[17-31]進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，S3-1與JD37與這些菌株的親緣關(guān)系較近（圖3）.例如：桔黃假單胞菌SR1是一種已有報(bào)道可用于大豆的生物防治以及促生的菌株，JD37與其具有較近的親緣關(guān)系，說(shuō)明該菌株在生物防治與促生應(yīng)用方面可能具有良好的潛力[32].

2.3 西紅柿果實(shí)干重、根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化率及其根長(zhǎng)、株高的測(cè)定結(jié)果

不同處理組的果實(shí)干重、根際微生物數(shù)量變化率、根長(zhǎng)和株高分別如圖4（a）～4（c）所示.

由圖4可知：S3-1與JD37菌液并沒(méi)有對(duì)提高西紅柿的果實(shí)干重起到顯著的促進(jìn)作用;JD37對(duì)增加西紅柿株高有顯著效果，同時(shí)也抑制了西紅柿根部的生長(zhǎng)（p<0.05）.而S3-1對(duì)于西紅柿株高與果實(shí)干重的影響與不接種菌株的LB培養(yǎng)基相比的差異并不顯著.由于植物根際存在根際效應(yīng)，所以其微生物數(shù)量?jī)H有非根際土壤中的5%左右，絕大部分文獻(xiàn)均以富集率來(lái)表示根際微生物的根際效應(yīng)[33].但這種方式卻忽略了不同地塊本身存在的微生物數(shù)量之間的差異，因此本實(shí)驗(yàn)采用變化率來(lái)表征根際微生物數(shù)量的變化.施加S3-1，JD37的處理組與未接種細(xì)菌的對(duì)照組相比，其細(xì)菌、放線菌的變化率均顯著增高（p<0.05）.

2.4 果實(shí)品質(zhì)測(cè)定結(jié)果

施加了S3-1的處理組，其可溶性糖質(zhì)量濃度比僅施加LB基質(zhì)的對(duì)照組顯著提升（p<0.05），但是與施加JD37的處理組相比，提升并不顯著，而施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對(duì)照組的可溶性糖質(zhì)量濃度相比并沒(méi)有顯著差異.就硝酸鹽質(zhì)量濃度而言，4個(gè)組均沒(méi)有顯著的差異（p>0.05），如圖5（a）所示.施加S3-1的處理組相較于只施加LB基質(zhì)的對(duì)照組，在可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提升上并不顯著（p>0.05），但是與施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對(duì)照組相比，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提升（p<0.05）.施加了S3-1的處理組的可滴定酸質(zhì)量濃度與僅施加LB基質(zhì)的對(duì)照組相比顯著上升（p<0.05），但與施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對(duì)照組相比，提升并不顯著（p>0.05），如圖5（b）所示.本實(shí)驗(yàn)用消耗的二氯酚靛酚體積來(lái)表示抗壞血酸含量，施加了S3-1，JD37的處理組與僅施加基質(zhì)的對(duì)照組相比，均顯著提升了西紅柿的抗壞血酸含量（p<0.05）.而4個(gè)組白利度（表征可溶性固形物含量）影響差異均不顯著（p>0.05），如圖5（c）所示.

圖6為果實(shí)品質(zhì)主成分分析（PCA）圖.由圖6可知，橫坐標(biāo)解釋了33.904%的變異度，縱坐標(biāo)解釋了26.362%的變異度，具有比較良好的解釋度.施加S3-1的處理組的果實(shí)品質(zhì)明顯聚為一類，僅施加LB基質(zhì)的對(duì)照組的果實(shí)品質(zhì)聚為一類，而施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對(duì)照組的果實(shí)品質(zhì)無(wú)法區(qū)分，表明兩者之間的差異并不明顯.因此S3-1能較好地提升西紅柿的果實(shí)品質(zhì)，而澆灌LB基質(zhì)也具有一定的促生作用.

2.5 對(duì)土壤酶活性的影響

施加 S3-1的處理組在3個(gè)月后，與僅施加KMB基質(zhì)的對(duì)照組相比，土壤中的脲酶活性（用NH+4 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征）顯著降低（p<0.05），但S3-1對(duì)蔗糖酶活性（用葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征）的影響并不顯著（p>0.05），如圖7所示.

3 討 論

IAA是植物體內(nèi)普遍存在的生長(zhǎng)激素，該生長(zhǎng)激素在一定濃度條件下能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[34].而蛋白酶能夠轉(zhuǎn)化土壤中的氮素，使其更易利用.同時(shí)，ACC脫氨酶能夠?qū)⒁种浦参锷L(zhǎng)的乙烯分解成氨和α-酮丁酸，從而保護(hù)植物免受脅迫[35].溶磷能力能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性的磷轉(zhuǎn)換成水溶性磷，從而提升土壤的質(zhì)量[36].鐵在地球上多以難溶性的氧化物形式存在，所以鐵離子的高效獲取對(duì)植物的生長(zhǎng)至關(guān)重要[37].通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，S3-1與JD37均具有以上促生能力，且通過(guò)對(duì)比已有文獻(xiàn)報(bào)道系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)兩株菌株也具有非常良好的生物防治潛力.

土壤中微生物數(shù)量的變化率可作為土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)[38].通過(guò)田間實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，更多可培養(yǎng)的細(xì)菌與放線菌被根際效應(yīng)阻擋，說(shuō)明施加S3-1與JD37增加了西紅柿根際的選擇性.當(dāng)然這也有可能是由于S3-1與JD37具有較強(qiáng)的定殖能力，從而搶占了其他細(xì)菌與放線菌原本的生態(tài)位.兩種菌劑對(duì)于真菌數(shù)量變化率的影響并不明顯，其原因可能為兩株菌與真菌均不處于同一生態(tài)位，或者兩者之間的相互關(guān)聯(lián)效應(yīng)較弱.

3個(gè)月后，施加S3-1的處理組與對(duì)照組相比，西紅柿果實(shí)中的可溶性糖、可溶性蛋白、可滴定酸、抗壞血酸的含量分別提升了5%，31%，11%，50%，這與侯樂(lè)梅等[39]的研究結(jié)果的趨勢(shì)是一致的.說(shuō)明施加S3-1能夠有效提升西紅柿果實(shí)的品質(zhì)，這可能是貝萊斯芽孢桿菌在土壤中的存活能力與抗逆性更強(qiáng)所導(dǎo)致的[40].而僅施加LB培養(yǎng)基的土壤也能略微提升果實(shí)品質(zhì)，但效果并不明顯.推測(cè)其原因可能是LB培養(yǎng)基也吸引了來(lái)自土壤中的芽孢桿菌屬細(xì)菌.相較之下，施加JD37的處理組與僅施加KMB培養(yǎng)基的對(duì)照組的果實(shí)品質(zhì)提升并不顯著，這可能是由于JD37在土壤中的適應(yīng)性相對(duì)較差，而KMB培養(yǎng)基無(wú)法吸引土壤中有提升果實(shí)品質(zhì)能力的微生物.所以就應(yīng)用方向而言，貝萊斯芽孢桿菌更適合作為微生物肥料.

酶是土壤或基質(zhì)中生物活性最強(qiáng)的部分，反映了土壤或基質(zhì)中各種生化過(guò)程的強(qiáng)度.酶活性可以作為評(píng)價(jià)土壤或基質(zhì)肥力狀況的生物活性指標(biāo)[39].曹銀珠等[41]研究表明脲酶的活性較低，可以有效地降低田間氮素的損失.本研究中發(fā)現(xiàn)施加S3-1能顯著地降低土壤中脲酶的活性（p<0.05），所以推測(cè)S3-1能夠有效地留存土壤中的氮素，從而提升果實(shí)的品質(zhì).而土壤中的蔗糖酶對(duì)土壤的碳循環(huán)有顯著影響，但本研究中發(fā)現(xiàn)4組處理組的蔗糖酶活性并沒(méi)有顯著性的差異.植物根際的微生物變化率顯示S3-1可能替代了土壤根際中與氮循環(huán)相關(guān)的微生物，因此S3-1能抑制土壤中的氮循環(huán)，但對(duì)土壤中的碳循環(huán)沒(méi)有明顯的抑制作用.

4 結(jié) 論

研究了貝萊斯芽孢桿菌S3-1與桔黃假單胞菌JD37的促生能力，結(jié)果顯示：貝萊斯芽孢桿菌S3-1能夠更有效地提升西紅柿的可溶性糖、可滴定酸、可溶性蛋白等物質(zhì)的含量，也能增加根際可培養(yǎng)微生物的變化率，同時(shí)能夠降低土壤的脲酶活性以減少氮素?fù)p失.相較于桔黃假單胞菌，貝萊斯芽孢桿菌S3-1有更強(qiáng)的定殖能力搶占生態(tài)位，更穩(wěn)定的產(chǎn)IAA能力，以及通過(guò)改變土壤酶活性來(lái)提升植物的果實(shí)品質(zhì)，更適合作為微生物肥料.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）