黃學(xué)思，彭 俊，蔣鵬飛，李苑碧，喻 娟，彭清華

0引言

青光眼是全球第二大致盲眼病[1]，目前治療方式是進(jìn)行濾過(guò)性手術(shù)，而濾過(guò)道瘢痕化是濾過(guò)性手術(shù)失敗最主要的原因。研究表明，膠原纖維、以α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)為特征表達(dá)的肌成纖維和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是濾過(guò)性手術(shù)后瘢痕形成的關(guān)鍵因素之一[2]。盡管抗代謝藥物如絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)等在手術(shù)中的應(yīng)用大大挺高了手術(shù)的成功率[3]，但是此類藥物廣泛作用于眼部組織，會(huì)導(dǎo)致濾過(guò)泡滲漏、眼內(nèi)感染等一系列并發(fā)癥，易給患者本來(lái)已經(jīng)損傷的視功能帶來(lái)新的威脅[4]。本課題組自主研制的青光安顆粒劑具有活血化瘀、利水明目的功用，應(yīng)用于術(shù)后抗濾過(guò)道瘢痕化療效顯著。本課題組前期通過(guò)在青光安顆粒劑中藥組份庫(kù)中建立高通量篩選藥物體系[5-6]，已經(jīng)篩選出4種青光安有效組份。本實(shí)驗(yàn)將4種青光安有效組份、青光安中藥混懸液以及絲裂霉素C應(yīng)用于手術(shù)動(dòng)物模型，通過(guò)觀察各組抑制膠原纖維、α-SMA和FN的表達(dá)情況，進(jìn)而抑制瘢痕組織增生的效果，來(lái)對(duì)比各有效組份術(shù)后抗濾過(guò)道瘢痕化的實(shí)際療效，為研制治療青光眼的藥物提供有力的物質(zhì)基礎(chǔ)支撐。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)新西蘭長(zhǎng)耳白兔48只(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量1.5～2.0kg，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前排除雙眼及全身病變，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)房，濕度50%～55%，室溫(23±2)℃，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[7]的規(guī)定。

1.1.2主要儀器設(shè)備和手術(shù)器材-80℃超低溫冰箱(中科美菱，DW-HL538)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXQ-LS-SⅡ)、凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1D)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，101-1AB型)、低溫臺(tái)式高速離心機(jī)(赫西儀器裝備有限公司，HR/T 16M)、超微量分光光度計(jì)(美國(guó)，Nanodrop)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)，Bio-Rad)、微量移液器(德國(guó)，Eppendorf)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo)、水平電轉(zhuǎn)槽(北京六一儀器廠，DYCP-40C)、超純水儀(Millipore公司)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海Spectrum公司，SP-752)、恒溫?fù)u床(金壇，THZ-82A)、水平搖床(北京六一儀器廠，WD-9405B)、掃描儀(日本Canon，9000F MarkⅡ)。

1.1.3主要藥品和試劑水合氯醛(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20151023)、絲裂霉素C、青光安4種有效組份、青光安混懸液、4%多聚甲醛、α-SMA單克隆抗體、FN單克隆抗體、SABC即用型試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)、DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將48只兔按體質(zhì)量平均分到A組(空白組)、B組(模型組，即手術(shù)對(duì)照組)、C組(絲裂霉素C對(duì)照組)、D組(有效組份1組)、E組(有效組份2組)、F組(有效組份3組)、G組(有效組份4組)、H組(青光安混懸液組)，每組6只兔子。

1.2.2青光眼濾過(guò)手術(shù)動(dòng)物模型建立耳緣靜脈注射10%水合氯醛溶液(按2～4mL/kg)麻醉兔子，使用壓陷式眼壓計(jì)測(cè)每只兔子術(shù)眼3次眼壓取平均值(保留小數(shù)點(diǎn)后1位數(shù))并記錄。生理鹽水沖洗術(shù)眼結(jié)膜囊后滴0.1%丁卡因進(jìn)行局部麻醉，在手術(shù)顯微鏡下行雙眼小梁切除+虹膜根部切除術(shù)[8]，除A組外，所有兔子均形成濾過(guò)泡。

1.2.3給藥方法A組、B組：術(shù)后第1d開(kāi)始以生理鹽水10mL/kg灌胃，每日1次，持續(xù)4wk。 C組：術(shù)中切除鞏膜和小梁組織前使用MMC，參照MMC在青光眼手術(shù)中的常用方法[5]，術(shù)后灌胃頻率、方法、時(shí)間同A、B組。D組、E組、F組、G組：術(shù)后第1d開(kāi)始以不同組份給藥，體表面積折算的等效劑量比值計(jì)算[6]，算出兔子的用藥劑量，溶于生理鹽水中，頻率、方法、時(shí)間同A、B組。H組：術(shù)后第1d開(kāi)始以成人臨床等效劑量的3.27倍給藥，溶于生理鹽水中，頻率、方法、時(shí)間同A、B組。

1.2.4術(shù)后眼壓測(cè)量與固定取材本實(shí)驗(yàn)中眼壓的測(cè)量方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。灌胃4wk后第1d取材?？諝馑ㄈㄌ幩劳米雍?，立即將眼球完整取出固定于4%多聚甲醛溶液中[9]，剪取眼球上手術(shù)區(qū)10mm×10mm范圍內(nèi)的方形全層眼球壁及其周邊組織，制作成石蠟切片備行Masson染色。

1.2.5濾過(guò)泡區(qū)域內(nèi)膠原纖維、α-SMA、FN的表達(dá)情況膠原纖維：取部分石蠟切片進(jìn)行Masson染色后，在光鏡400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，觀察膠原纖維占視野面積的比值情況，并取平均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。取部分石蠟切片做免疫組化后，在光鏡400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，測(cè)定α-SMA、FN的平均光密度，計(jì)算平均值作為樣本中α-SMA、FN的表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1術(shù)后各組眼壓測(cè)量情況實(shí)驗(yàn)中無(wú)兔子死亡或消耗，除A組外，各組術(shù)前、術(shù)后2d，1、2、4wk眼壓比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)間的眼壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.831，P=0.002)。B組術(shù)后2、4wk眼壓相比術(shù)前，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明B組手術(shù)2wk后眼壓已基本恢復(fù)到術(shù)前水平。C組術(shù)后各時(shí)期相比術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明C組在手術(shù)后眼壓一直處于較低水平。D組術(shù)后4wk相比術(shù)前，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明D組所用藥物組份在術(shù)后4wk對(duì)抑制眼壓上升無(wú)明顯作用。E組術(shù)后各時(shí)期相比術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明E組所用組份對(duì)于抑制眼壓上升有效。F組術(shù)后4wk相比術(shù)前，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明F組所用組份在術(shù)后4wk對(duì)于抑制眼壓上升無(wú)效。G組術(shù)后2、4wk相比術(shù)前，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明G組所用組份在術(shù)后2、4wk對(duì)于抑制眼壓上升無(wú)效。H組術(shù)后各時(shí)期相比術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明H組所用組份對(duì)于抑制眼壓上升有效。同一時(shí)間點(diǎn)不同組別的眼壓有差別(F=27.256，P<0.001)。術(shù)后2wk B組與A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.801，P=0.221)，術(shù)后2wk G組與A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.114，P=0.030)，表明手術(shù)2wk后G組對(duì)于抑制眼壓上升無(wú)效，見(jiàn)表1。

圖1各組濾過(guò)泡區(qū)域膠原纖維表達(dá)情況(Masson染色×400)A：A組膠原纖維較少，形態(tài)規(guī)則，排列整齊；B:B組膠原纖維大量增生，排列不規(guī)則；C：C組膠原纖維增生較少，排列尚規(guī)則；D：D組膠原纖維增生較多，排列較為紊亂；E：E組膠原纖維密度較低，排列尚規(guī)則；F：F組可見(jiàn)大量生成的膠原纖維排列不規(guī)則；G：G組膠原纖維致密粗大，排列不規(guī)則；H：H組膠原纖維排列稀疏，且邊界清楚。

組別術(shù)前術(shù)后2d 術(shù)后1wk 術(shù)后2wk 術(shù)后4wk A組17.64±0.5917.17±1.3716.80±0.4616.37±0.7016.69±0.85B組16.72±1.249.50±0.95a,c13.85±0.95a,c16.02±0.8116.40±0.80C組17.15±1.148.73±0.89a,c9.33±1.07a,c10.56±1.39a,c11.08±1.73a,cD組16.51±1.389.08±0.78a,c11.54±0.98a,c14.16±1.06a,c15.63±1.63E組17.55±0.889.25±0.59a,c11.49±0.89a,c12.11±0.99a,c13.77±0.69a,cF組17.84±1.129.19±0.98a,c11.60±0.91a,c14.54±1.23a,c15.13±1.80aG組17.55±1.069.58±0.85a,c12.22±0.79a,c15.58±0.5916.42±0.51H組18.26±1.089.25±0.67a,c10.93±0.80a,c11.88±0.79a,c13.49±0.62a,c

注：A組：空白組；B組：模型組，即手術(shù)對(duì)照組；C組：絲裂霉素C對(duì)照組；D組：有效組份1組；E組：有效組份2組；F組：有效組份3組；G組：有效組份4組；H組：青光安混懸液組。aP<0.05vsA組；cP<0.05vs同組術(shù)前。

2.2濾過(guò)泡區(qū)域膠原纖維表達(dá)情況各組濾過(guò)泡區(qū)膠原纖維面積比值相比A組(0.0512±0.0078)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明各組濾過(guò)泡區(qū)膠原纖維都有不同程度增殖。D組(0.1774±0.0047)、G組(0.1829±0.0188)相比B組(0.1840±0.1505)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.1074，P=0.458；t=0.0178，P=0.493)，說(shuō)明D組和G組所用藥物組份對(duì)于抑制膠原纖維增殖基本無(wú)效。C組(0.0732±0.0109)、E組(0.0824±0.0105)、F組(0.1294±0.0375)、H組(0.0970±0.0150)相比B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明E組、F組采用的藥物組份對(duì)于抑制膠原纖維增殖有效。H組相比E組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.953，P=0.960)，說(shuō)明其抑制膠原纖維增殖的效果與E組無(wú)明顯差異。各組膠原纖維表達(dá)情況見(jiàn)圖1。

2.3濾過(guò)泡區(qū)域α-SMA表達(dá)情況各組α-SMA平均光密度相比A組(0.290±0.032)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明各組肌成纖維都有不同程度增殖。G組(0.594±0.042)相比B組(0.606±0.036)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.531，P=0.303)，說(shuō)明G組藥物組份對(duì)于抑制α-SMA增殖基本無(wú)效。而C組(0.392±0.047)、D組(0.543±0.038)、E組(0.459±0.046)、F組(0.493±0.024)、H組(0.424±0.030)相比B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明D組、E組、F組所用的藥物組份對(duì)于抑制α-SMA增殖有效。H組相比E組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.561，P=0.075)，說(shuō)明其抑制α-SMA增殖的效果與E組無(wú)明顯差異。各組α-SMA表達(dá)情況見(jiàn)圖2。

圖2各組濾過(guò)泡區(qū)域α-SMA表達(dá)情況(SABC×400)A：A組正常組織α-SMA含量少，陽(yáng)性細(xì)胞不明顯；B：B組α-SMA高度表達(dá)，排列致密，形態(tài)不規(guī)則；C:C組α-SMA表達(dá)較少，排列稀疏；D：D組α-SMA表達(dá)明顯增高；E：E組α-SMA表達(dá)較C組有所增加，但排列尚整齊；F：F組α-SMA表達(dá)較E組有所增加，排列不規(guī)則；G：G組α-SMA表達(dá)明顯增高，排列不規(guī)則；H：H組α-SMA表達(dá)不明顯，排列較稀疏。

圖3各組濾過(guò)泡區(qū)域FN表達(dá)情況(SABC×400)A:A組正常組織中FN表達(dá)較少；B：B組FN高度表達(dá)，排列致密，形態(tài)不規(guī)則；C:C組FN表達(dá)較正常組高，但是低于其他組；D：D組FN表達(dá)明顯增高，僅次于B組；E：E組FN表達(dá)較C組高，排列尚整齊；F：F組FN表達(dá)較E組多，且排列致密；G：G組FN呈高度表達(dá)，排列紊亂致密；H:H組FN表達(dá)較C組增高，但不及E組，排列較稀疏。

2.4濾過(guò)泡區(qū)域FN表達(dá)情況各組FN平均光密度相比A組(0.250±0.075)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明各組FN都有不同程度增殖。D組(0.625±0.077)、G組(0.592±0.073)相比B組(0.642±0.067)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.408，P=0.346；t=1.236，P=0.122)，說(shuō)明D組、G組藥物組份對(duì)于抑制FN增殖基本無(wú)效。而C組(0.368±0.038)、E組(0.447±0.110)、F組(0.540±0.090)、H組(0.390±0.077)相比B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明這些組對(duì)于抑制FN增殖都有不同程度的效果。H組相比E組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.040，P=0.161)，說(shuō)明其抑制FN的增殖效果與E組無(wú)明顯差異。各組FN表達(dá)情況見(jiàn)圖3。

3討論

青光眼濾過(guò)性手術(shù)術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化是青光眼濾過(guò)性手術(shù)失敗的主要原因[9]，目前普遍認(rèn)為瘢痕形成主要與膠原纖維合成增多、成纖維細(xì)胞以及肌成纖維細(xì)胞的增生有關(guān)。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的重要構(gòu)成部分[10]，其在肌成纖維細(xì)胞中的高表達(dá)會(huì)使肌成纖維細(xì)胞處于活化狀態(tài)[11-12]，肌成纖維細(xì)胞合成膠原的能力顯著提升，最終瘢痕形成，導(dǎo)致青光眼濾過(guò)性手術(shù)失敗[13]。FN是對(duì)膠原蛋白有特殊親和力的高分子糖蛋白，創(chuàng)傷處的成纖維細(xì)胞合成纖維連接蛋白[14]，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架，參與抗青光眼濾過(guò)性手術(shù)術(shù)后瘢痕形成[15]。

青光安顆粒劑是彭清華教授在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，以益氣養(yǎng)陰、活血利水為原則，研制而成中藥復(fù)方制劑[16]。青光安顆粒劑能明顯減少術(shù)后濾過(guò)道瘢痕的形成，前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究未發(fā)現(xiàn)青光安顆粒劑4種有效組份對(duì)眼部組織的毒副作用，可能成為抗青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化，提高手術(shù)成功率的一個(gè)全新安全藥物。為了進(jìn)一步研究青光安抗青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化的作用機(jī)制，本課題組前期通過(guò)對(duì)青光安50多種中藥組份建立高通量篩選體系，篩選出4種青光安有效組份，它們均可以有效抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化。

本實(shí)驗(yàn)以青光安4種有效組份與空白組、模型組、MMC組及青光安混懸液組進(jìn)行比較，在術(shù)后眼壓方面、濾過(guò)道瘢痕化方面對(duì)4種組份的療效進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMC組、有效組份2組和青光安混懸液組能有效控制青光眼濾過(guò)性手術(shù)術(shù)后眼壓；MMC組、有效組份2組、有效組份3組和青光安混懸液組均可有效抑制膠原纖維增殖，其中MMC組效果最佳；MMC組對(duì)α-SMA增殖有明顯的抑制作用，有效組份2組、有效組份3組與青光安混懸液組也可有效抑制α-SMA增殖，有效組份1組與有效組份4組對(duì)α-SMA增殖幾乎無(wú)抑制作用；MMC組對(duì)FN增殖有明顯抑制作用，青光安混懸液組、有效組份2組及有效組份3組對(duì)FN增殖均有抑制作用，有效組份4組與有效組份1組對(duì)FN增殖抑制作用不明顯。

本實(shí)驗(yàn)表明，MMC、青光安有效組份2、青光安有效組份3及青光安混懸液通過(guò)抑制α-SMA及FN的增殖而體現(xiàn)出對(duì)肌成纖維細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的抑制作用，具有明顯的抗瘢痕化作用。