李 笑 羅興才 王佐廣 吳瓊 辛毅 劉潔琳 劉雅 魏永祥

增殖性心血管疾?。╬roliferative cardiovascular diseases，PCVDs）如動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈損傷后再狹窄和高血壓等是導(dǎo)致全球人類死亡的主要原因之一，其特征是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成［1］。 值得注意的是，VSMCs增殖在PCVDs中的作用尚未完全闡明［2］。因而，探討VSMCs的增殖機(jī)制并找出調(diào)節(jié)其增殖的關(guān)鍵物質(zhì)，已成為防治高血壓、冠心病等各種PCVDs的重點(diǎn)［3］。

2004年，陳光慧等發(fā)現(xiàn)的一種基因線粒體融合基因2（Mitofusin 2，Mfn2）在自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs） 的VSMCs、 心臟、大腦中的表達(dá)顯著下調(diào)［4］。迄今為止，雖然Mfn2對(duì)VSMCs增殖的負(fù)向調(diào)控作用已明確，但Mfn2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明［4-5］。

激活蛋白1（activator protein 1，AP1）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，以高度保守的二聚體堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）DNA結(jié)合域?yàn)樘卣?，是由Jun（v-Jun、c-Jun、JunB和JunD）、Fos（v-Fos、c-Fos、Fos b、Fra-1和Fra-2）、ATF（ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1和JDP2） 和MAF（c-Maf、MafB、MafA、MafG/F/K和Nrl）蛋白家族組成的同源或異源二聚體，其中典型的是由c-Jun與c-Fos組成的異源二聚體［6］。大量證據(jù)表明AP1經(jīng)過(guò)AKT1/AP1［7］、JNK和AP1［8］等多種信號(hào)通路參與了VSMCs的增殖。

本研究的目的是探討轉(zhuǎn)錄因子c-Jun對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞（hVSMCs）中Mfn2表達(dá)的調(diào)控作用，為Mfn2在EH、冠心病及其他PCVDs的表達(dá)下調(diào)提供線索并提供其潛在的治療靶點(diǎn)，同時(shí)為預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后再狹窄提供參考。

材料與方法

1.siRNA、慢病毒載體與試劑 c-Jun siRNA及對(duì)照siRNA購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自英格恩生物公司。c-Jun基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體（GV358）和空載體、感染添加劑、感染增強(qiáng)溶液購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與處理 hVSMCs來(lái)源于正常人主動(dòng)脈的中間層，購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。將細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)皿內(nèi)，以添加了10%胎牛血清（Gibco）、100 U/mL鏈霉素和100 mg/mL青霉素的DMEM（Thermo Scientific）為培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃含5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基隔天更換，3～4 d達(dá)到融合。

3.siRNA轉(zhuǎn)染 提前24 h將hVSMCs以3×105個(gè)細(xì)胞/2 mL/孔的密度接種到6孔板中，然后轉(zhuǎn)染時(shí)即鋪板第二天細(xì)胞匯合度約為30%。依照轉(zhuǎn)染試劑EntransterTM-R4000說(shuō)明進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為每孔:2.412μg siRNA，3.6μL EntransterTM-R4000，轉(zhuǎn)染并繼續(xù)培養(yǎng)26 h后，分別提取細(xì)胞RNA、蛋白進(jìn)行RT-PCR、Western blot分析結(jié)果。c-Jun siRNA靶序列為:5'-CAAACCTCAGCAACTTCAA-3'。

圖1 慢病毒載體（GV358）及克隆位點(diǎn)圖譜（MCS為多克隆位點(diǎn)）

4.慢病毒轉(zhuǎn)染 提前一天用完全培養(yǎng)基制備密度為3×104個(gè)/mL的hVSMCs細(xì)胞懸液，并將hVSMCs以3×104個(gè)細(xì)胞/2 mL/孔的密度接種到6孔板中。利用由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司構(gòu)建的攜帶c-Jun基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體（GV358，圖1）的慢病毒轉(zhuǎn)染hVSMCs，轉(zhuǎn)染體系見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染10 h后，換回常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染約96 h，熒光表達(dá)豐度較高時(shí)，用顯微鏡觀察，然后分別提取細(xì)胞RNA、蛋白做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（RT-PCR、Western blot）分析結(jié)果。

表1 慢病毒轉(zhuǎn)染體系

5.RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞c-Jun和Mfn2的mRNA水平 根據(jù)Trizol試劑（Invitrogen）從hVSMCs中提取總RNA。按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。測(cè)定RNA濃度和純度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物用Primer-BLAST進(jìn)行設(shè)計(jì)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

6.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞c-Jun和Mfn2的蛋白水平用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取hVSMCs總蛋白。根據(jù)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Thermo Scientific）測(cè)定蛋白濃度。用10% SDSPAGE凝膠將蛋白樣品電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore）上，用5% BSA封閉液室溫封閉1 h，分別對(duì)應(yīng)加入一抗c-Jun（No.9165；Cell Signaling，1∶1 000），Mfn2（No.11925；Cell Signaling，1∶1 000），和GAPDH（No.GA003-R； 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，1∶2 500），4℃搖床上孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）洗膜3次，10 min/次。用IRDye 680RD?山羊抗兔（No.926-68071；LI-COR，Inc.，1∶10 000）室溫孵育1 h。使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)（基因公司）掃描和光密度分析。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）和LSD post hoc比較得出多重比較的P值。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Mfn2在轉(zhuǎn)錄因子c-Jun敲除hVSMCs中的表達(dá)情況 在光鏡下，siRNA干擾組hVSMCs數(shù)目較陰性siRNA對(duì)照組和正常對(duì)照組明顯增加（圖2 A）。此外，在熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)的hVSMCs中Cy3的表達(dá)，經(jīng)熒光標(biāo)記的非靶向siRNA處理的hVSMCs中有大量的亮紅色熒光，表明其轉(zhuǎn)染效率較高。進(jìn)一步用RT-PCR在培養(yǎng)的hVSMCs中檢測(cè)到Mfn2的表達(dá)（圖2B），siRNA干擾組（0.671±0.061）明顯低于陰性siRNA對(duì)照組（1.110±0.080，P＜0.01）和正常對(duì)照組（1.000±0，P＜0.01）。 此外，與陰性siRNA對(duì)照組（1.042±0.039，P＜0.01）和正常對(duì)照組（1.000±0，P＜0.01）相比，用Western blot檢測(cè)到siRNA干擾組（0.571±0.049）Mfn2蛋白水平（圖2C）顯著降低。

2.過(guò)表達(dá)c-Jun后hVSMCs中Mfn2的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染慢病毒并繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，用熒光顯微鏡察看培養(yǎng)的hVSMCs中EGFP的表達(dá)狀況。病毒組有大量亮綠色熒光（圖3 A），這表明轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高。進(jìn)一步用RT-PCR檢測(cè)到慢病毒過(guò)表達(dá)組（1.414±0.063）在培養(yǎng)的hVSMCs中Mfn2 mRNA的表達(dá)（圖3B）明顯高于陰性病毒對(duì)照組（1.056±0.020，P＜0.01）和正常對(duì)照組（1.000±0，P＜0.01）。此外，與陰性病毒對(duì)照組（1.089±0.026，P＜0.01）和正常對(duì)照組（1.000±0，P＜0.01）相比，用Western blot檢測(cè)到慢病毒過(guò)表達(dá)組（1.449±0.044）Mfn2蛋白水平（圖3C）顯著升高。值得注意的是，慢病毒轉(zhuǎn)染96 h后，在光鏡下觀察到慢病毒過(guò)表達(dá)組的hVSMCs數(shù)量明顯低于陰性病毒對(duì)照組和正常對(duì)照組（圖3 A）。

討 論

在前期研究中，我們已經(jīng)報(bào)道了Mfn2的表達(dá)在高血壓患者的血管組織和VSMCs中明顯低于對(duì)照組，且在SHR VSMCs內(nèi)顯著低于WKY大鼠［9-11］。關(guān)于Mfn2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制方面，目前國(guó)內(nèi)、外已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，如Sorianello E等的研究報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白質(zhì)1（Sp1）是VSMCs中正向調(diào)控Mfn2表達(dá)的關(guān)鍵因子之一［12］。然而，他們僅部分闡明了Mfn2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，且轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著十分重要的作用，因此研究除Sp1外的其他轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Mfn2的調(diào)控非常重要。

表2 所用引物序列、退火溫度及其擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小

圖2 siRNA敲減c-Jun抑制了培養(yǎng)的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá) A:不同siRNA轉(zhuǎn)染26 h后，光鏡下hVSMCs的增殖情況；B:以GAPDH為對(duì)照的代表性RT-PCR及c-Jun和Mfn2的mRNA表達(dá)定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。 與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性siRNA對(duì)照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01；C:以GAPDH為對(duì)照的代表性蛋白質(zhì)印跡及c-Jun和Mfn2的蛋白表達(dá)定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性siRNA對(duì)照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01

圖3 過(guò)表達(dá)c-Jun促進(jìn)了培養(yǎng)的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá) A:用攜帶不同慢病毒載體的慢病毒處理培養(yǎng)的hVSMCs 96 h后，熒光顯微鏡下EGFP的表達(dá)和hVSMCs的增殖情況；B:未轉(zhuǎn)染或用攜帶過(guò)表達(dá)c-Jun基因慢病毒載體的慢病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的hVSMCs后，c-Jun對(duì)hVSMCs中Mfn2 mRNA表達(dá)的影響。以GAPDH為對(duì)照的代表性RT-PCR及c-Jun和Mfn2的mRNA表達(dá)定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。 與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性對(duì)照病毒組相比，?P＜0.05，??P＜0.01；C:以GAPDH為對(duì)照的代表性蛋白質(zhì)印跡及c-Jun和Mfn2的蛋白表達(dá)定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性對(duì)照病毒組相比，?P＜0.05，??P＜0.01

目前已證實(shí)人類c-Jun定位于1號(hào)染色體短臂32.1部位。轉(zhuǎn)錄因子c-Jun通過(guò)靶基因如EGFR和FAS等參與了廣泛的細(xì)胞進(jìn)程，包括增殖、分化和凋亡［13］。許多研究已報(bào)道c-Jun通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)涉及VSMCs增殖、遷移、ROS產(chǎn)生和胞外基質(zhì)降解的細(xì)胞過(guò)程的多種基因，在VSMCs增殖中起著重要作用［14-15］。由于已有大量研究表明Mfn2在增殖的VSMCs中 低 表 達(dá)［5］，c-Jun也 與VSMCs增 殖 有關(guān)［14］，因此，我們推測(cè)Mfn2可能是轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的潛在靶基因之一，并且我們前期生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Mfn2基因啟動(dòng)子區(qū)存在著c-Jun結(jié)合位點(diǎn)。然而，目前尚未檢索到國(guó)、內(nèi)外對(duì)于c-Jun與Mfn2相關(guān)的報(bào)道。

為了闡明c-Jun對(duì)Mfn2的調(diào)控作用，本研究首先采用了比較經(jīng)典可靠的RNA干擾實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)用c-Jun siRNA處理培養(yǎng)的hVSMCs沉默靶基因c-Jun后（圖2），與陰性siRNA對(duì)照和正常對(duì)照組相比，siRNA干擾組Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而hVSMCs的數(shù)量明顯增多，表明c-Jun siRNA在培養(yǎng)的hVSMCs中干擾成功，且能抑制Mfn2的表達(dá)并促進(jìn)hVSMCs的增殖。

本研究進(jìn)一步應(yīng)用慢病毒過(guò)表達(dá)載體將c-Jun基因轉(zhuǎn)入hVSMCs。研究結(jié)果顯示，當(dāng)hVSMCs被攜帶c-Jun基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的慢病毒轉(zhuǎn)染后（圖3），慢病毒過(guò)表達(dá)組Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而hVSMCs的數(shù)量明顯減少，提示過(guò)表達(dá)c-Jun可以促進(jìn)Mfn2的表達(dá)從而抑制hVSMCs的增殖。結(jié)合RNA干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以得知c-Jun在轉(zhuǎn)錄水平上能正向調(diào)控Mfn2的表達(dá)；而且在翻譯水平上，c-Jun與Mfn2的表達(dá)趨勢(shì)也一致。在調(diào)控機(jī)制方面，由于Mfn2基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，因此，c-Jun對(duì)Mfn2的調(diào)控機(jī)制也可能是通過(guò)與其啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。此外，本研究表明hVSMCs的增殖隨Mfn2基因表達(dá)的變化而出現(xiàn)相應(yīng)的變化，這與以前的研究結(jié)果即Mfn2可以負(fù)向調(diào)控VSMCs的增殖一致［9-10］。

關(guān)于Mfn2調(diào)控VSMCs增殖方面，已有研究報(bào)道Mfn2通過(guò)抑制ras-raf-MEK/MAPK信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)而抑制VSMCs增殖［4］，值得注意的是，c-Jun在VSMCs增殖中的作用也與ras-raf-MEK/MAPK信號(hào)通路有關(guān)［16］，因而，c-Jun在VSMCs增殖中的調(diào)控作用可能是通過(guò)Mfn2基因與此信號(hào)通路關(guān)聯(lián)的，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究首次證明c-Jun在培養(yǎng)的hVSMCs中調(diào)控Mfn2的表達(dá)。下調(diào)c-Jun的表達(dá)可以導(dǎo)致培養(yǎng)的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低；而上調(diào)c-Jun的表達(dá)可引起培養(yǎng)的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加，并影響hVSMCs增殖。因此，c-Jun可能是一種新的調(diào)節(jié)Mfn2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這為Mfn2在EH和其他PCVDs增殖的hVSMCs中低表達(dá)的進(jìn)一步研究提供了參考。