董雪純，魏海峰,*，劉長(zhǎng)發(fā)

1. 遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)，大連 116023

多環(huán)芳烴(PAHs)作為環(huán)境中一種常見的有機(jī)污染物，廣泛分布于我國(guó)從南到北的海水和海洋沉積物中[1-3]，具有難降解、持久性、半揮發(fā)性及生物富集等特點(diǎn)，具有生物毒性和致畸、致癌、致突變作用[4]，其中16種PAHs被美國(guó)環(huán)保局(USEPA)列為優(yōu)先控制污染物[5]。環(huán)境中的PAHs來(lái)源于有機(jī)物質(zhì)不完全燃燒的過(guò)程、工業(yè)過(guò)程和溢油[6]。PAHs類污染物不僅易在水生生物體內(nèi)蓄積[7]，產(chǎn)生從分子水平到組織器官、個(gè)體水平的負(fù)面效應(yīng)[8-9]，還通過(guò)食物鏈進(jìn)行傳遞和遷移，破壞生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而威脅人類健康[10]。關(guān)于水環(huán)境中多環(huán)芳烴的毒性效應(yīng)研究主要集中于魚類和無(wú)脊椎動(dòng)物[11-12]，且多選擇最敏感的早期生命階段進(jìn)行暴露試驗(yàn)[13-16]。急性毒性試驗(yàn)是一種常用于快速評(píng)估化學(xué)品對(duì)水生生物潛在危害的生態(tài)毒理學(xué)方法，積累的大量數(shù)據(jù)可以用于確定大量化學(xué)品對(duì)生物的相對(duì)毒性[17]，也用于確定水體中污染物的安全濃度[18]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)，屬海參綱，棘皮動(dòng)物門。全身長(zhǎng)滿肉刺，以海底藻類和浮游生物為食，廣泛分布于世界各大海洋中，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種，具有提高記憶力、延緩衰老，預(yù)防動(dòng)脈硬化以及抗腫瘤等作用[19-20]，而成為我國(guó)重要的人工養(yǎng)殖海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。因此，環(huán)境污染物對(duì)其幼體和成體的毒性效應(yīng)及其體內(nèi)積累殘留污染物研究受到關(guān)注，這些污染物有：重金屬[21-22]、有機(jī)污染物[23-25]、農(nóng)藥等[26-28]。動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，原腸胚是是細(xì)胞核開始起主導(dǎo)作用，組織器官發(fā)生開始的發(fā)育階段，研究污染物對(duì)原腸胚發(fā)育期的毒性效應(yīng)具有更為重要的意義。但PAHs對(duì)刺參原腸胚發(fā)育的毒性研究尚未見報(bào)道。為此，開展PAHs對(duì)仿刺參原腸胚發(fā)育的毒性研究，探究仿刺參原腸胚對(duì)PAHs污染的耐受能力，對(duì)提高仿刺參品質(zhì)，加強(qiáng)海洋環(huán)境的資源利用與保護(hù)也具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以仿刺參原腸胚為研究對(duì)象，進(jìn)行半靜水式急性毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同濃度的苯并[a]芘、3-甲基菲、惹烯、2-甲基蒽分別在24、48、72、96 h觀察仿刺參存活率的差異，求出各條件下仿刺參原腸胚的半致死濃度、安全濃度，旨在為評(píng)估PAHs對(duì)海洋環(huán)境和水生生物質(zhì)量安全濃度提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)仿刺參原腸胚購(gòu)自大連海寶漁業(yè)有限公司，為受精24 h后的原腸期胚胎，體長(zhǎng)約280 μm。實(shí)驗(yàn)海水為大連黑石礁海域的砂濾海水，定期換水，每24 h投喂1 mL密度為1×104cells·mL-1的鹽藻，24 h持續(xù)微充氣。多環(huán)芳烴苯并[a]芘、3-甲基菲、惹烯和2-甲基蒽均購(gòu)自Sigma公司，純度大于96%。

儲(chǔ)存液配制：稱取一定量的苯并[a]芘、3-甲基菲、惹烯和2-甲基蒽固體，用丙酮作助溶劑溶解，配制成高濃度的儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要，向?qū)嶒?yàn)海水中添加不同體積的儲(chǔ)備液稀釋至實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的不同藥物濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)在10 mL的試管中進(jìn)行，每個(gè)試管中胚胎的密度為2～3 個(gè)·mL-1，為滿足實(shí)驗(yàn)仿刺參原腸胚對(duì)溶解氧的需求，實(shí)驗(yàn)海水在實(shí)驗(yàn)期間采用持續(xù)微充氣的方法，保證實(shí)驗(yàn)水體中溶解氧大于6 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)方式為半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每24 h更換一次水，水體控制在水溫20～21 ℃，鹽度30～31，pH 8.1～8.2的條件下。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，在此濃度范圍內(nèi)分別設(shè)置苯并[a]芘、3-甲基菲、2-甲基蒽及惹烯濃度為10、50、100、200 μg·L-1的4個(gè)濃度梯度組，一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè)0.1%丙酮溶劑對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并分別在24、48、72、96 h觀察記錄其存活數(shù)，計(jì)算存活率，安全濃度和半致死濃度，及時(shí)清除死亡個(gè)體。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，求出存活率和4種多環(huán)芳烴濃度對(duì)數(shù)的回歸方程，分別計(jì)算每組的半致死濃度和安全濃度。

半致死濃度計(jì)算方法采用概率單位法計(jì)算，以寇氏法(Karber)求半數(shù)致死濃度(LC50)。根據(jù)24 h和48 h的半致死濃度計(jì)算出安全濃度(SC)[29]。

LC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]

LogLC50的95%置信限=LogLC50±1.96×d[Σ(P×g/n)]0.5

SC=48 h-LC50×0.3/(24 h-LC50/48 h-LC50)2

公式中：Xm為最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)值，i為相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差，P為各組動(dòng)物的死亡率，d為相鄰劑量組比值的對(duì)數(shù)；g為存活率；n為每組受試刺參原腸胚數(shù)。

利用SPSS 19.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析多環(huán)芳烴組和對(duì)照組之間的差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 4種PAHs對(duì)仿刺參原腸胚發(fā)育的急性毒性影響

圖1表示各組實(shí)驗(yàn)的存活率以及顯著性差異。由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行24，48 h時(shí)，4組仿刺參原腸胚存活率均較高。實(shí)驗(yàn)72 h時(shí)，苯并[a]芘50 μg·L-1濃度組的存活率顯著下降，100、200 μg·L-1濃度組存活率為0；3-甲基菲、惹烯50、100 μg·L-1濃度組存活率顯著下降，200 μg·L-1濃度組存活率均為0；2-甲基蒽10、50、100 μg·L-1濃度組存活率均顯著下降。實(shí)驗(yàn)96 h時(shí)，苯并[a]芘10 μg·L-1濃度組存活率顯著下降，50、100、200 μg·L-1濃度組存活率為0；3-甲基菲10、50 μg·L-1濃度組存活率顯著下降，100、200 μg·L-1濃度組存活率為0；惹烯50、100 μg·L-1濃度組存活率顯著下降，200 μg·L-1濃度組存活率為0；2-甲基蒽100、200 μg·L-1濃度組存活率均顯著下降。在急性毒性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，2個(gè)對(duì)照組存活率高，4組PAHs不同濃度下仿刺參原腸胚的個(gè)體存活率隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和PAHs濃度的升高而降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖1 4種多環(huán)芳烴對(duì)仿刺參早期發(fā)育的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of acute toxicity test of four polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on early development of Apostichopus japonicus

2.2 4種PAHs對(duì)仿刺參原腸胚的半致死濃度和安全濃度

4種PAHs對(duì)仿刺參原腸胚在24、48、72、96 h的表觀半致死濃度及安全濃度結(jié)果詳見表1。苯并[a]芘對(duì)仿刺參原腸胚在24、48 h的半致死濃度分別為294.4、225.64 mg·L-1，3-甲基菲對(duì)仿刺參原腸胚在24、48、72、96 h的半致死濃度分別為404.5、300.7、81.4、17.6 mg·L-1，惹烯對(duì)仿刺參原腸胚在24、48、72 h的半致死濃度分別為243.1、230、186 mg·L-1，2-甲基蒽對(duì)仿刺參原腸胚在24、48、72、96 h的半致死濃度分別244、231.6、152.6、142.9 mg·L-1。PAHs的安全濃度順序?yàn)?-甲基蒽(62.6 mg·L-1)>惹烯(61.8 mg·L-1)>3-甲基菲(49.8 mg·L-1)>苯并[a]芘(39.76 mg·L-1)。

3 討論(Discussion)

多環(huán)芳烴(PAHs)有機(jī)污染物在環(huán)境中，主要來(lái)源于有機(jī)物和化石燃料的不完全燃燒，已被聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)列入持久性有毒化學(xué)污染物(PTS)名錄[30]。根據(jù)國(guó)家環(huán)保局1986制訂的《生物技術(shù)檢測(cè)規(guī)范(水環(huán)境部分)》標(biāo)準(zhǔn)(劇毒：LC50≤0.1 mg·L-1；高毒：0.1 mg·L-1﹤LC50≤ 1.0 mg·L-1；中毒：1.0 mg·L-1﹤LC50≤ 10.0 mg·L-1；低毒：LC50>10.0 mg·L-1)，苯并[a]芘、3-甲基菲、惹烯、2-甲基蒽4種PAHs均具有毒性作用，毒性大小排序?yàn)椋罕讲a]芘>3-甲基菲>惹烯>2-甲基蒽。本實(shí)驗(yàn)研究表明苯并[a]芘和3-甲基菲對(duì)仿刺參原腸胚的毒性作用較大，在高濃度、長(zhǎng)時(shí)間脅迫下，超過(guò)仿刺參原腸胚對(duì)PAHs毒性的耐受范圍將引起大量死亡，符合上述標(biāo)準(zhǔn)。4種PAHs在100、200 μg·L-1濃度組，72、96 h后存活率顯著下降，與空白對(duì)照組和丙酮對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。同時(shí)以丙酮作為助溶劑與對(duì)照組相比，沒有顯著差異，說(shuō)明丙酮作為助溶劑是可行的。采用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型研究芳烴化合物對(duì)小球藻的抑制作用的結(jié)果表明，不同多環(huán)芳烴的毒性程度各不相同，取代基基團(tuán)的種類多、苯環(huán)數(shù)量多的化合物毒性高[31]。由于電性是控制其反應(yīng)性毒性的參數(shù)之一，氫鍵成鍵能力是決定其毒性的參數(shù)之一，所以芳烴中能夠形成氫鍵的取代基對(duì)其毒性影響較大。在酚類化合物對(duì)水生生物的毒性研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)取代基數(shù)量越多，化合物的毒性作用越大；取代基的種類不同，毒性也不同[32]。

表1 4種多環(huán)芳烴對(duì)仿刺參早期發(fā)育的回歸方程、半致死濃度和安全濃度Table 1 Regression equation, semi-lethal concentration and safe concentration of four PAHs on the early development of Apostichopus japonicus

注：Y為存活率；x為PAHs濃度對(duì)數(shù)。

Note:Yis the survival rate;xis the logarithm of the PAHs concentration.

對(duì)PAHs致毒機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，PAHs對(duì)魚類胚胎發(fā)育的影響包括：卵黃囊和心包水腫、出血、心臟功能紊亂、結(jié)合芳基烴受體(AHR)和誘導(dǎo)CYP1A、后代突變和遺傳性變化、顱面和脊柱畸形、神經(jīng)細(xì)胞死亡、貧血、生長(zhǎng)抑制和游泳障礙等[33]。其中，干擾心臟功能被認(rèn)為通過(guò)2種途徑導(dǎo)致胚胎心力衰竭[34-35]：(1)抑制心內(nèi)驅(qū)動(dòng)心臟動(dòng)作電位復(fù)極化的鉀通道整流作用；(2)通過(guò)阻斷ryanodine受體或肌漿網(wǎng)鈣泵干擾心肌細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)；間接破壞魚類胚胎骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞導(dǎo)致骨骼畸形；呈現(xiàn)內(nèi)分泌干擾活性；肝臟、腦和肌肉組織的DNA甲基化水平升高[36]。

仿刺參原腸胚在暴露于PAHs后其存活率隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和暴露濃度的升高而顯著下降，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，暴露時(shí)間越長(zhǎng)，PAHs濃度越高對(duì)仿刺參原腸胚的毒害作用越大。而PAHs對(duì)仿刺參原腸胚產(chǎn)生毒性作用的機(jī)理是否與魚類胚胎發(fā)育或者其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的致毒機(jī)理一致，有必要進(jìn)一步深入研究。