王愛云，曹滕飛，呂家森, #，叢明

1. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺 264025 2. 煙臺大學(xué)生命學(xué)院，煙臺 264003 3. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，煙臺 264003

近岸海域是海水增養(yǎng)殖的重要區(qū)域，其水質(zhì)狀況直接制約著該區(qū)域水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展?！吨袊逗Ｓ颦h(huán)境質(zhì)量公報》顯示，我國近岸海域的局部海域水質(zhì)污染程度較重，無機氮是主要的污染因子之一[1-3]，而氨氮和亞硝態(tài)氮是水環(huán)境中2種主要的有毒含氮化合物。環(huán)境中的氨氮在氨氧化細(xì)菌的作用下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮，后者在硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化成硝酸氮。由于近岸海洋環(huán)境中含氮有機污染物的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過環(huán)境微生物的硝化能力，因此亞硝態(tài)氮成為近海海域一種常見的含氮污染物。我國淺海灘涂為貝類的黃金養(yǎng)殖地帶，近岸的亞硝態(tài)氮也就成為貝類養(yǎng)殖環(huán)境中不可忽視的污染物之一，嚴(yán)重威脅貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。國內(nèi)外關(guān)于亞硝態(tài)氮對貝類的生態(tài)毒理研究，主要集中在致死效應(yīng)和生理生化反應(yīng)等方面[4-7]，毒性相關(guān)基因的研究比較少。

為了更好地研究亞硝態(tài)氮對貝類的毒性效應(yīng)，尤其是從基因角度評價亞硝態(tài)氮毒性效應(yīng)，需要一個合適的內(nèi)參基因作為評價標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)文獻報道，0.1～0.5 mg·L-1的亞硝酸鹽(以氮計)能對水生生物造成中毒癥狀，超過0.1 mg·L-1時會造成魚蝦等慢性中毒，而當(dāng)亞硝酸氮濃度達到0.5 mg·L-1時，則會導(dǎo)致養(yǎng)殖生物大面積死亡[8-9]。為了研究低濃度亞硝態(tài)氮對貝類的毒性影響情況，本實驗采用0.2 mg·L-1亞硝酸氮作為脅迫濃度。貝類的鰓組織是重要的攝食、呼吸器官，也是與外界海水環(huán)境進行接觸的主要器官，因此被認(rèn)為是最易受到外界環(huán)境脅迫的靶器官。本研究以菲律賓蛤仔的鰓組織為研究對象，采用0.2 mg·L-1亞硝酸氮作為脅迫濃度對菲律賓蛤仔進行不同時間(1 d、7 d)的脅迫實驗，利用內(nèi)參基因分析軟件geNorm和NormFinder篩選穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。本研究的順利開展，將為研究菲律賓蛤仔鰓組織的毒理機制，篩選毒性關(guān)鍵基因提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；為從基因的角度系統(tǒng)研究亞硝態(tài)氮對貝類的致毒機理，防治亞硝態(tài)氮引致的危害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實驗用菲律賓蛤仔購于山東省煙臺市大潤發(fā)超市，選取足部伸縮有力、健康的菲律賓蛤仔(11±2.0) g作為實驗對象，暫養(yǎng)10 d。暫養(yǎng)和脅迫期間，全天連續(xù)充氣，水溫(20±2) ℃，鹽度30.0，pH值8±0.1，實驗用海水經(jīng)過3級沙濾，每日喂食螺旋藻液1次(終濃度為5×103cells·mL-1左右)，在喂食前和喂食2 h后100%換水各1次。每天喂食換水后，在脅迫組水體中加入新鮮配制的亞硝酸鈉母液，使其氮濃度達到0.2 mg·L-1。亞硝酸氮濃度每天于喂食換水前和喂食2 h換水后各檢測1次(檢測方法參照GB/T 7493—1987)，亞硝酸氮濃度范圍為(0.24±0.04) mg·L-1。實驗設(shè)置脅迫時間為7 d，分別在實驗的第1和7天取樣，作為急性和亞急性脅迫樣品。

實驗用亞硝態(tài)氮源為亞硝酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn), 分析純)，烘干至恒重，用0.22 μm濾膜過濾除菌的海水配成1 mol·L-1的母液，避光冷藏保存，備用。本實驗設(shè)2組：對照組(0 mol·L-1)，脅迫組(0.2 mol·L-1)，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)用菲律賓蛤仔30只。每個重復(fù)隨機選取6只菲律賓蛤仔，取其鰓組織，將其完全浸入TRIzol液中，-20 ℃保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA制備

用Trizol (TaKaRa)試劑盒提取菲律賓蛤仔鰓組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳(12.0 g·L-1)檢測其完整性和純度，用紫外分光光度計NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, America)確定RNA濃度，-80 ℃保存樣品總RNA。用試劑盒EraserPrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 大連)去除基因組DNA (gDNA)后，再進行反轉(zhuǎn)錄實驗，獲得菲律賓蛤仔鰓組織的cDNA。采用SYBR Green qPCR (染料法)，使用20.0 μL的反轉(zhuǎn)錄體系，加入總RNA 1.0 μg、去除gDNA的反應(yīng)液10 μL，其他成分和用量參照試劑盒說明；反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃儲存，最后于-20 ℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

圖1 對照組和亞硝態(tài)氮脅迫組菲律賓蛤仔鰓組織總RNA凝膠電泳圖譜注：C1～12，Control組樣品1～12；N1～12，亞硝態(tài)氮脅迫組樣品1～12。Fig. 1 Gel electrophoresis of total RNA samples from the gill tissues of R. philippinarum in the control and nitrite-exposed groupsNote: C1-12 represented samples from the control groups; N1-12 represented samples from the nitrite-exposed groups.

1.3 引物特異性檢測

本研究選取微管蛋白基因(beta-tubulin,Tubu)、肌動蛋白基因(β-actin,Actin)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(elongation factor 1-alpha,EF1α)、核糖體(18SrRNA, 18S)、泛素蛋白基因(Ubiquitin,Ubi)和親環(huán)素基因(cyclophilin A,CyPA)等6個基因作為候選內(nèi)參基因。根據(jù)課題組前期實驗結(jié)果[10]，選用6對候選內(nèi)參基因的引物并交由生工生物技術(shù)(上海)有限公司合成。利用普通PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳(12.0 g·L-1)驗證6對引物的可靠性。20.0 μL的PCR反應(yīng)體系包括10 × PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，MgCl21.2 μL，Taq 0.2 μL，上、下游引物各1.0 μL，以等量混合的脅迫組和對照組鰓組織RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA做模板，用量1.0 μL，RNAase-Free Water 10.1 μL。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)36次，最后，72 ℃保溫10 min，產(chǎn)物4 ℃儲存。

1.4 實時熒光定量PCR的擴增

將亞硝態(tài)氮脅迫的實驗組及對照組的cDNA各取2.0 μL混勻，將其濃度分別稀釋20、50、100、200、500倍作cDNA模板。按照SYBR Select Master qRT-PCR試劑盒 (MixApplied Biosystems, America)使用說明，在7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, America)上進行擴增反應(yīng)。20.0 μL的反應(yīng)體系包括SYBR Select Master Mix 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL，cDNA(50×)模板5 μL，ddH2O 3.8 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性10 s；60 ℃退火延伸30 s；循環(huán)40次。擴增實驗結(jié)束后，進行熔解曲線分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)7500 System Software獲取的qRT-PCR擴增曲線，用-2-ΔΔCt法[11]計算樣本的相對表達量；分別利用軟件geMorm和NormFinder對6個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性值(expression stability value,M)進行評價，再采用加權(quán)賦值法[12]綜合比較基因的表達穩(wěn)定性，從而確定最適合的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果(Results)

2.1 總RNA提取

隨機選取2個處理組的24個樣品進行瓊脂糖凝膠(1.2 g·L-1)電泳檢測，發(fā)現(xiàn)樣品總RNA 28S、18S、5S的條帶清晰(圖1)。NanoDrop 2000檢測其A260/A280在1.8～2.0范圍內(nèi)，A260/A230均大于2.0，說明RNA的提取質(zhì)量符合后續(xù)的qRT-PCR要求。

2.2 cDNA質(zhì)量和引物特異性檢測

以鰓組織的混合cDNA為模板進行普通PCR擴增后，用12.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物均為單一清晰條帶，且產(chǎn)物大小與目標(biāo)產(chǎn)物大小匹配。熒光定量PCR熔解曲線分析顯示，6對引物的擴增產(chǎn)物均呈現(xiàn)單一峰且重復(fù)性好(圖2)。由此說明，所采用的6對引物不存在非特異性擴增，也沒有形成引物二聚體，均適用于qRT-PCR分析。將模板進行不同濃度梯度稀釋后用引物擴增，結(jié)果表明，cDNA模板稀釋50倍時，內(nèi)參基因的Ct值均在12.0～25.0范圍內(nèi)，適合作為檢測的模板濃度。

2.3 內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性評估

2.3.1 geNorm軟件評估

將對照組和亞硝態(tài)氮脅迫(1 d、7 d)的菲律賓蛤仔的鰓組織cDNA分別進行qRT-PCR擴增，用-2-ΔΔCt法計算出各候選基因的相對表達量，將其值輸入geNorm軟件進行分析。根據(jù)分析結(jié)果，獲得6個候選內(nèi)參基因的平均表達穩(wěn)定值M：18S(1.066)、Actin(0.829)、Tubu(1.195)、EF1α(0.938)、Ubi(0.948)和CyPA(0.882) (表1)。依據(jù)geNorm軟件的分析原則，M值越小，則說明該基因表達越穩(wěn)定。因此，候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性由高到低依次排序為Actin>CyPA>EF1α>Ubi>18S>Tubu，即Actin和CyPA的表達相對穩(wěn)定。

圖2 菲律賓蛤仔6個候選內(nèi)參基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線Fig. 2 Melting curves of 6 candidate reference genes from R. philippinarum

表1 geNorm評估6個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性情況Table 1 Stability values of 6 candidate reference genes calculated by geNorm

注：C1、C2、C3表示對照組1、2、3號樣品；1day-1、1day-2、1day-3表示亞硝態(tài)氮脅迫1天的樣品1、2、3號；7day-1、7day-2、7day-3表示亞硝態(tài)氮脅迫7天的樣品1、2、3號。

Note: C1, C2, C3 stand for control 1, control 2, control 3; 1day-1, 1day-2, 1day-3 stand for sample 1, sample 2, sample 3 exposed to nitrite for 1 day; 7day-1, 7day-2, 7day-3 stand for sample1, sample 2, sample 3 exposed to nitrite for 7 days.

為了校正系統(tǒng)偏差，geNorm軟件一般選出2個以上的候選基因作為內(nèi)參基因。內(nèi)參基因數(shù)目的多少主要通過計算內(nèi)參基因的配對差異值Vn/Vn+1來確定，其配對差異值以0.15為默認(rèn)取舍值。當(dāng)配對差異值小于0.15時，候選內(nèi)參基因中適合作qRT-PCR內(nèi)參基因的數(shù)目確定為n個[13]。本研究中配對差異值均大于0.15(圖3)。

2.3.2 NormFinder軟件評估

NormFinder軟件通過程序運行生成基因表達的穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越低表明內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定[14]。由軟件分析結(jié)果可知(表2)，基因的穩(wěn)定性由高到低依次為Actin>Ubi>CyPA>EF1α>18S>Tubu，即Actin的表達穩(wěn)定性最好。

2.3.3 內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性綜合分析

根據(jù)軟件geNorm和NormFinder的分析結(jié)果，采用加權(quán)賦值法[12]，對每個基因的表達穩(wěn)定性分別賦值后再求和，依據(jù)分?jǐn)?shù)越小穩(wěn)定性越好的原則，對結(jié)果重新排序，分?jǐn)?shù)最小者排在第1位，其他依次排名為2、3、4、5、6位。統(tǒng)計結(jié)果顯示(表3)，得分最低的是Actin(2分)，排名第1，說明6個候選內(nèi)參基因中Actin的表達穩(wěn)定性最高，其他依次為CyPA、Ubi、EF1α、18S、Tubu。由此說明，菲律賓蛤仔受到亞硝態(tài)氮脅迫后，鰓組織中Actin基因的表達比較穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參基因?qū)ζ渌虻谋磉_水平進行標(biāo)準(zhǔn)化分析。

3 討論(Discussion)

使用qRT-PCR技術(shù)分析目標(biāo)基因的表達趨勢時，往往把內(nèi)參基因作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對照進行校正[15]。在貝類生物中，開展了很多篩選相關(guān)內(nèi)參基因的工作，為進一步研究貝類分子毒理學(xué)提供了參考依據(jù)。Bai等[16]篩選出了三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)在生物礦化過程中的內(nèi)參基因Ubi、Rpl18和EF1α；不同組織和發(fā)育時期的合浦珠母貝(Pinctadafucata)[17]、不同發(fā)育階段和雌激素暴露后的櫛孔扇貝(Chlamysfarrer)[18]、以及多氯聯(lián)苯脅迫下紅樹蜆(Polymesodaerosa)[19]體內(nèi)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為Actin。鮑相渤等[20]分別探討了饑餓、致病菌感染和環(huán)境水溫脅迫條件下蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)成體的鰓、腎、閉殼肌組織、外套膜、血淋巴和肝胰腺等不同組織的適宜內(nèi)參基因。本研究通過qRT-PCR比較了菲律賓蛤仔在亞硝態(tài)氮脅迫下鰓組織的6個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，確定了Actin為其最適內(nèi)參基因。

圖3 geNorm評估6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性Fig. 3 Stability values of 6 reference genes calculated by geNorm

表2 NormFinder評估6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性Table 2 Stability values of 6 reference genes calculated by NormFinder

表3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合分析Table 3 Comprehensive weighting comparison of reference genes’ stability

有大量研究認(rèn)為，同一管家基因在不同細(xì)胞類型和不同生理狀態(tài)下的表達并不是恒定不變的[19,21-22]，但Actin基因的表達量在超過90%研究條件下都處于穩(wěn)定狀態(tài)，適合單獨作為qRT-PCR的內(nèi)參基因[23]。本研究所測試的6個表達量相對穩(wěn)定的基因中，Actin基因同樣是表達水平最為穩(wěn)定的一個。曹滕飛等[10]確定了氨氮脅迫后菲律賓蛤仔鰓組織中最適宜的內(nèi)參基因為EF1α。由此可見，利用qRT-PCR研究基因表達的穩(wěn)定性時，即便是同一物種的同一組織處于不同脅迫條件下，內(nèi)參基因的選擇也會不同[19]，需要具體情況具體分析。

目前，用于評價內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的常用軟件有g(shù)eNorm、NormFinder、BestKeeper等，但是采用不同軟件分別分析得到的排序結(jié)果之間往往存在差異，導(dǎo)致排序不一致，而綜合多個軟件的分析結(jié)果相互驗證則可提高研究的準(zhǔn)確性[19,24-25]。geNorm是Vandesompele等[26]2002年開發(fā)的一款用于微軟Excell平臺的VBA宏程序，將計算平均表達穩(wěn)定值M作為基因穩(wěn)定性的評價指標(biāo)，據(jù)M值分析得出配對差異值(Vn/Vn+1)，其配對差異值一般以0.15為默認(rèn)取舍值，若Vn/Vn+1<0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量為n個；若Vn/Vn+1>0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量為(n+1)個。NormFinder是Andersen等[14]2004年研發(fā)的篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的另一款程序，其程序計算原理和geNorm相似，也是先獲得內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值M，再根據(jù)M值的大小來篩選最適合的內(nèi)參基因，M值越小越穩(wěn)定。前者可用于篩選任何樣品的任何數(shù)量的內(nèi)參基因，通過程序分析后確定適合的內(nèi)參基因和最適宜的內(nèi)參基因數(shù)目；后者則不僅能比較內(nèi)參基因的表達差異，還可以計算樣品組間的差異，但只能篩選出一個最適合的內(nèi)參基因[27]?？紤]到兩者程序計算原理的相似性，本實驗采用了geNorm和NormFinder兩個篩選軟件的評價結(jié)果相互驗證，但兩個軟件所獲得的基因表達穩(wěn)定性順序出現(xiàn)了不一致，故利用Su等[12]的加權(quán)賦值法，綜合比較了geNorm和NormFinder的評價結(jié)果，從而獲得了這6個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，表達較為穩(wěn)定的基因為Actin和CyPA，Actin為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

使用geNorm軟件分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性時，可根據(jù)Vn/Vn+1(<0.15時)來確定內(nèi)參基因的適宜數(shù)目，但geNorm使用指南中也明確地指出0.15并非嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)值。多項實驗研究中也出現(xiàn)了差異分析值大于0.15的情況，鮑相渤等[20]認(rèn)為不同組織間的Vn/Vn+1大于0.15，是不同組織的細(xì)胞類型和比例不同以及實驗中的候選基因有限所致。Li等[28]認(rèn)為，在人類卵巢腫瘤的內(nèi)參基因選擇中，Vn/Vn+1大于0.15是由內(nèi)參基因的表達受組織類型及患者年齡、腫瘤的所處階段等生理因素和病理因素的影響不同而造成的。Penning等[29]比較貓不同組織中的10個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)，需同時選用6個內(nèi)參基因才能保證對所有組織進行最佳標(biāo)準(zhǔn)化，而此時的Vn/Vn+1亦大于0.15。蔣婷婷等[30]對石蒜屬(Lycoris)植物內(nèi)參基因的篩選、曹騰飛等[10]在篩選氨氮脅迫下菲律賓蛤仔的內(nèi)參基因時均遇到了Vn/Vn+1大于0.15的情況，但結(jié)果并未拘泥于Vn/Vn+1≤0.15。本實驗中差異分析值Vn/Vn+1大于取舍值0.15，可能是在亞硝態(tài)氮脅迫后的不同時間段取材所導(dǎo)致的。