朱曉瑩，甘宏濤，孟霄，姚海洋，徐國成1,，徐加濤，劉統(tǒng)昊，曹黎鑫，許星鴻1,,*

1. 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮海工學(xué)院，連云港 222005 2. 淮海工學(xué)院 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，連云港 222005

重金屬鎘(Cd)是一種極易蓄積且半衰期長的有毒污染物，會對生物體的免疫和生殖系統(tǒng)造成損傷，還具有致癌、致畸等作用[1]。近年來隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，水環(huán)境中的Cd污染程度也日益嚴(yán)重，不但會影響水生生物的生理機(jī)能，還會通過食物鏈富集對人體健康構(gòu)成威脅。單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)分布于黃、渤海泥沙岸潮間帶及潮下帶，其富含必需氨基酸、不飽和脂肪酸和微量元素，提取物有一定抗腫瘤和提高免疫力的作用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好的開發(fā)利用前景[2]。目前對單環(huán)刺螠的研究主要集中于纖溶酶的分離純化和溶栓作用，以及對硫化物的應(yīng)激代謝等方面[3-4]，而重金屬對單環(huán)刺螠的毒性報(bào)道很少，僅見唐永政等[5]檢測了3種重金屬離子(Cu2+、Hg2+、Cd2+)對幼螠的急性毒性。本文研究了單環(huán)刺螠在不同質(zhì)量濃度Cd脅迫下，其免疫相關(guān)指標(biāo)及組織中Cd蓄積量的變化規(guī)律，旨在探討Cd對單環(huán)刺螠的毒性效應(yīng)，為養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控及海洋環(huán)境監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用單環(huán)刺螠于2017年12月購自連云港市水產(chǎn)品市場，平均體長為(12.1±1.5) cm，平均體質(zhì)量為(21.2±4.2) g，于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。暫養(yǎng)條件為：鹽度25，pH 8，水溫(15±1) ℃，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂1次小球藻(Chlorellapacifica)，藻液密度104mL-1，投喂量10 mL·L-1，實(shí)驗(yàn)所用海水均用曝氣自來水和海水晶配制，經(jīng)檢測其Cd含量為0.001 mg·L-1，為實(shí)驗(yàn)用海水本底。選擇大小相近、體表無損傷及活力強(qiáng)者用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)國家《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607—1989)[6](Cd質(zhì)量濃度≤0.005 mg·L-1)及海水中Cd通常的污染濃度[7]，本實(shí)驗(yàn)Cd質(zhì)量濃度設(shè)置為對照組0.005 mg·L-1、0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1，用氯化鎘(分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)配制的1 g·L-1原液調(diào)節(jié)各處理組Cd濃度。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)放40條單環(huán)刺螠，于50 cm×60 cm×60 cm養(yǎng)殖箱中飼養(yǎng)，養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時(shí)相同，每日定時(shí)換水1次，每次換水50%，并維持各組氯化鎘質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)期間不喂食，以消除餌料的影響。于處理0、3、6、12、24、48、72和96 h，每組隨機(jī)取3條單環(huán)刺螠，解剖取其血液，保留一部分全血用于測定血細(xì)胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，取上清液即血清，-80 ℃保存，用于測定免疫相關(guān)指標(biāo)。于實(shí)驗(yàn)5、10、15 d，每組取3條單環(huán)刺螠，解剖取其肌肉和消化道，-80 ℃保存，用于檢測組織中Cd蓄積量。

1.3 檢測方法

免疫相關(guān)指標(biāo)選用血細(xì)胞密度(density of hemocyte, DHC)、血清總蛋白含量，酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、溶菌酶(lysozyme, LSZ)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力，過氧化氫(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。將抽取的一部分血液按1:1比例與檸檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose, ACD)抗凝劑充分混勻，用血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司，規(guī)格為16×25格)計(jì)數(shù)，然后按照文獻(xiàn)[8]計(jì)算血細(xì)胞密度。血清中總蛋白含量采用雙縮脲試劑法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用T6紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)于540 nm進(jìn)行比色測定[9]。PO和LSZ活力分別采用Ashida[10]、Hultmark等[11]方法進(jìn)行測定。SOD活力、過氧化氫(H2O2)和MDA含量分別參照南京建成生物工程研究所的H2O2和MDA測試盒說明進(jìn)行測定。取肌肉和消化道2種組織經(jīng)濕法消化(V(HNO3)∶V(HClO4)=2∶1)，1% HNO3溶解，過濾，定容至25 mL，采用全譜直讀電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(美國Thermo fisher iCAP 6300型，檢出限為ppb級)測定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，LSD多重比較和Duncan檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為0.05。

圖1 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度(DHC)和血清總蛋白含量的影響注：上標(biāo)不同小寫字母的數(shù)值表示同一測試時(shí)間不同處理組間差異顯著(P<0.05，余同)。Fig. 1 Effect of Cd stress on the density of hemocyte (DHC) and the total protein content in serum of Urechis unicinctusNote: The values of different lowercase letters in the superscript indicate that the differences between the groups are significant at the same test time (P<0.05, the same below).

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度和血清總蛋白含量的影響

如圖1所示，在Cd脅迫下，處理組血細(xì)胞密度(DHC)總體呈“先升后降再升”的趨勢。處理3 h，處理組DHC均顯著升高，以低濃度組DHC上升較快，在脅迫24 h時(shí)升至最大值。處理至96 h，處理組DHC均顯著高于對照組(P<0.05)，呈顯著的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，而各實(shí)驗(yàn)組總蛋白含量變化不顯著(P>0.05)。

2.2 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中PO和LSZ活力的影響

從圖2可以看出，各處理組PO活力總體呈先升后降的趨勢。PO活力以較高脅迫濃度組(0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1)上升較快，于處理24 h且升高幅度較大。0.005 mg·L-1組于48 h達(dá)到最大值，隨后逐漸下降。至處理96 h，0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1兩組PO活力顯著低于對照組和0.005 mg·L-1組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)期間，隨脅迫時(shí)間延長，0.005 mg·L-1組PO活力沒有明顯時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系，而0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1兩組PO活力在3～24 h內(nèi)與脅迫時(shí)間和Cd質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)(P<0.05)，在24～96 h內(nèi)為顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

Cd脅迫下，LSZ活力呈先降后升再降的趨勢。處理3 h，各處理組LSZ活力均出現(xiàn)顯著下降，以較高脅迫濃度組(0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1)下降幅度較大，于處理6 h出現(xiàn)明顯回升。隨著脅迫時(shí)間延長，處理組LSZ活力在回升后又呈下降趨勢。處理72 h后，各處理組LSZ活力均顯著低于對照組(P<0.05)，在實(shí)驗(yàn)期間，各處理組LSZ活力有波動(dòng)，沒有明顯的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中SOD活力的影響

Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中SOD活力的影響如圖3所示。隨脅迫時(shí)間延長，各處理組SOD活力總體呈緩慢上升趨勢，除處理3 h的0.005 mg·L-1組以外，其他各處理組SOD活力均高于對照組，且在實(shí)驗(yàn)期間，SOD活力與脅迫時(shí)間呈顯著的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，而與Cd質(zhì)量濃度沒有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P>0.05)。

圖2 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中酚氧化酶(PO)和溶菌酶(LSZ)活力的影響Fig. 2 Effect of cadmium stress on the activity of phenoloxidase (PO) and lysozyme (LSZ) in serum of Urechis unicinctus

圖3 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響Fig. 3 Effect of cadmium stress on the activity of superoxide dismutase (SOD) in serum of Urechis unicinctus

圖4 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中H2O2和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 4 Effect of cadmium stress on the content of H2O2 and malondialdehyde (MDA) in serum of Urechis unicinctus

2.4 Cd脅迫對單環(huán)刺螠血清中H2O2和MDA含量的影響

由圖4可見，各處理組H2O2含量呈先升后降再升的趨勢。H2O2含量于暴露6 h升到最大值，且存在顯著的劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；隨后又快速下降，于12 h降至最低，均低于對照組，隨后又逐漸上升。至96 h時(shí)，各處理組H2O2含量均高于對照組。Cd脅迫下，處理組MDA含量總體呈緩慢上升趨勢，至96 h，各處理組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，且在3～6 h內(nèi)，MDA含量與脅迫時(shí)間和Cd質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)(P<0.05)，在72～96 h則顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.5 Cd脅迫對單環(huán)刺螠組織蓄積的影響

如圖5所示，隨Cd暴露時(shí)間延長，各處理組單環(huán)刺螠體壁肌肉和消化道中Cd含量均呈上升趨勢，且存在顯著的劑量-濃度效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。Cd在單環(huán)刺螠機(jī)體的蓄積具有組織特異性，消化道中的蓄積量顯著多于體壁肌肉(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 Cd脅迫對單環(huán)刺螠非特異性免疫的影響

有研究表明環(huán)境變化會對血細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生顯著影響，水生動(dòng)物DHC常作為生物體免疫狀態(tài)的衡量指標(biāo)[12]。擬穴青蟹(Scyllaparamamo)在不同濃度(0.0025、0.05、0.075和0.1 mg·L-1) Cd脅迫后，短時(shí)間內(nèi)DHC顯著降低，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，脅迫至9 d后，較低濃度(0.0025和0.05 mg·L-1)處理組DHC恢復(fù)至對照組水平[13]。長臂蝦(Palaemonelegans)經(jīng)Cd暴露后8 h，其DHC顯著下降，而后又逐漸升高[14]。本研究中，Cd脅迫96 h后，單環(huán)刺螠DHC各處理組均顯著高于對照組，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，與上述研究結(jié)果相近。表明生物體對Cd脅迫具有一定的適應(yīng)性，在脅迫濃度較低時(shí)，對機(jī)體的毒害作用較小，較高脅迫濃度則會引起明顯的應(yīng)激反應(yīng)，DHC顯著變化，而且不同水生動(dòng)物對Cd脅迫的響應(yīng)存在差異。

Zahedi等[15]將波斯鱘(Acipenserpersicus)幼體暴露于0.68 mg·L-1的Cd中14 d，魚體血清總蛋白含量無顯著變化；將鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)置于0.01 mg·L-1的Cd中脅迫96 h，其血清總蛋白含量變化不明顯[16]，與本研究結(jié)果一致，表明Cd脅迫對機(jī)體血清總蛋白含量可能影響不大。

PO是水生無脊椎動(dòng)物非特異性免疫防御系統(tǒng)中的重要成員[17]。秦圣娟等[18]報(bào)道，隨著Cd濃度增大，長江華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)血清中PO活力總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，與本研究結(jié)果一致。表明PO對金屬離子較為敏感，在機(jī)體受到環(huán)境中重金屬離子的脅迫時(shí)，免疫系統(tǒng)中PO被誘導(dǎo)產(chǎn)生，以防御外界環(huán)境脅迫對機(jī)體的損傷。而在長時(shí)間的較高濃度Cd脅迫下，免疫機(jī)能受到影響，所以出現(xiàn)隨暴露時(shí)間延長，PO活力逐漸下降的現(xiàn)象。

圖5 Cd脅迫對單環(huán)刺螠肌肉和消化道中Cd蓄積量的影響Fig. 5 Effects of cadmium stress on the cadmium accumulation of the muscle and the digestive tract of Urechis unicinctus

LSZ是體液免疫中重要成分之一，Cd會和溶菌酶的活性位點(diǎn)直接結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)和功能，且不同濃度的Cd與溶菌酶的結(jié)合能力不同，因而對酶活性也會有不同程度的影響[19]。李慧等[20]研究發(fā)現(xiàn)0.05和0.5 mg·L-1的Cd可引起鯉魚(Cyprinuscarpio)血清中LSZ活力顯著升高；王志和武二栓[21]研究表明鯉魚血清中LSZ含量隨Cd濃度增加而升高，且高濃度組顯著高于對照組。本研究中，單環(huán)刺螠LSZ活力在Cd脅迫下總體呈先升后降的趨勢，至脅迫72 h后，各處理組LSZ活力均顯著低于對照組，表明Cd脅迫對單環(huán)刺螠的抗菌能力影響較大，不同生物體應(yīng)對Cd脅迫的免疫機(jī)制亦不同。

3.2 Cd脅迫對單環(huán)刺螠抗氧化能力的影響

正常情況下，生物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2等成分會被抗氧化系統(tǒng)中相關(guān)酶清除，維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)，而當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境因子脅迫時(shí)，其含量會發(fā)生變化。研究表明，Cd會抑制機(jī)體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的活性，促使H2O2含量增加，誘發(fā)氧化損傷、細(xì)胞凋亡等過程[26]。Wang等[27]研究表明淡水蟹(Sinopotamonhenanense)在暴露于濃度為58 mg·L-1的Cd后，與對照組相比，鰓中H2O2含量在2～4 h顯著增加，8 h后逐漸下降，處理24～48 h后再次增加。薛蓓等[28]發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦(Palaemoncarincauda)暴露于Cd后，0.005 mmol·L-1組在短時(shí)間內(nèi)H2O2含量變化比其他處理組更明顯，脅迫至24 h后，各實(shí)驗(yàn)組與對照組均不存在顯著性差異。本研究中，各處理組H2O2含量于6 h時(shí)達(dá)到最大值，且差異顯著；隨后快速下降，于12 h降至最低，均低于對照組；96 h時(shí)，各處理組H2O2含量均高于對照組，且各處理組間差異不顯著。表明單環(huán)刺螠在受到Cd短期脅迫后，其體內(nèi)產(chǎn)生的大量H2O2得不到及時(shí)清除而積聚在體內(nèi)，致使其含量迅速上升，Cd濃度越高，單環(huán)刺螠體內(nèi)的H2O2含量相對越高；而隨脅迫時(shí)間延長，各處理組的H2O2含量逐漸下降，是由于機(jī)體受到Cd脅迫后誘導(dǎo)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生相關(guān)酶，使體內(nèi)過剩的H2O2被及時(shí)清除。

MDA是由自由基與生物膜中的脂類形成的過氧化產(chǎn)物，可通過MDA的含量反映膜脂過氧化程度及膜系統(tǒng)的受損程度。0.005 mmol·L-1濃度的Cd暴露后，脊尾白蝦MDA含量快速上升，于9 h時(shí)達(dá)到最大值，且顯著高于對照組及其他各處理組，隨后又逐漸下降，而較低濃度(0.001和0.002 mmol·L-1)組MDA的含量變化則相對緩慢[28]。本研究中，0.005和0.05 mg·L-1濃度組MDA含量總體呈緩慢上升趨勢，而0.5 mg·L-1濃度組則先升高后降低。這與上述研究結(jié)果相似。這可能是單環(huán)刺螠在短時(shí)間內(nèi)受到較高濃度Cd脅迫后，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基成分未及時(shí)清除而使脂質(zhì)過氧化過程加劇，MDA含量增加；隨脅迫時(shí)間的延長，單環(huán)刺螠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗氧化相關(guān)酶，清除了機(jī)體內(nèi)過剩的自由基成分，MDA含量相應(yīng)下降。

綜上所述，Cd脅迫會刺激機(jī)體產(chǎn)生自由基和H2O2等成分，進(jìn)入體內(nèi)的Cd首先可能通過誘導(dǎo)合成大量非特異性免疫機(jī)制中的PO、LSZ等一些酶類以及金屬硫蛋白基因的大量表達(dá)，進(jìn)行結(jié)合進(jìn)入體內(nèi)多余的Cd2+，起到暫時(shí)解毒的作用，其次會誘導(dǎo)抗氧化機(jī)制中的SOD等抗氧化酶成分，用于清除體內(nèi)過剩的氧自由基、H2O2等成分，H2O2含量則會快速下降；當(dāng)脅迫時(shí)間過長時(shí)，體內(nèi)進(jìn)入過多的Cd，超出了免疫系統(tǒng)中的酶類可以結(jié)合的上限，多余的Cd會持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基、H2O2等成分，與生物膜中的脂類形成的過氧化產(chǎn)物MDA，故MDA會持續(xù)增加。因此MDA含量可作為單環(huán)刺螠在Cd環(huán)境中長期脅迫后的免疫檢測指標(biāo)。

3.3 Cd脅迫對單環(huán)刺螠組織蓄積的影響

相關(guān)研究表明，水生生物對重金屬Cd的蓄積具有組織特異性[29-30]。于淑池等[31]報(bào)道波紋巴非蛤(Paphiaundulata)于安全濃度下(0.02767 mg·L-1)下脅迫120 h，其體內(nèi)Cd的蓄積量水平依次為內(nèi)臟團(tuán)>鰓>肌肉；Charan-Dixon等[32]用質(zhì)量濃度分別為15 μg·L-1、765 μg·L-1的Cd脅迫海參(Australostichopusmollis)，結(jié)果表明其呼吸腸中Cd的蓄積量高于體壁肌肉；張林寶等[25]研究表明菲律賓蛤仔肝胰腺與鰓的Cd蓄積量隨Cd濃度與暴露時(shí)間的增加而增大。本實(shí)驗(yàn)中，單環(huán)刺螠用不同質(zhì)量濃度(0.005、0.05和0.5 mg·L-1)的Cd脅迫5 d、10 d、15 d后，其消化道Cd的蓄積量顯著高于肌肉，且呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，與上述報(bào)道的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)閱苇h(huán)刺螠不同組織對重金屬的吸收、代謝及調(diào)節(jié)能力不同，可直接通過攝食經(jīng)消化道吸收水體或殘留在餌料中的重金屬，因而消化道內(nèi)Cd含量高于肌肉。