趙斌 張敏敏 蘇子涵 孫凱 藏萃妮 孫璐瑤

（1，濰坊工商職業(yè)學(xué)院 262200；2，山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

水貂出血性肺炎[1]是由銅綠假單胞菌（ Pseudomonasaeruginosa，PA）又稱綠膿桿菌引起的急性傳染病，多發(fā)生于夏季炎熱潮濕季節(jié)，以出血性肺炎為主要特征，發(fā)病急，死亡快，常呈地方性暴發(fā)性流行，給養(yǎng)貂業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。肺炎克雷伯氏菌[2](KlebsIella Peneumoniae) 屬腸桿菌科菌屬克雷伯氏菌種，典型的條件致病菌，在自然界、人和動物體內(nèi)廣泛存在。當(dāng)水貂換毛抵抗力下降或本菌大量增殖時，會引起水貂發(fā)病甚至暴發(fā)性流行。肺炎克雷伯氏菌引起的感染已上升到僅次于銅綠假單胞菌，居革蘭氏陰性菌感染的第2位，且兩者常呈混合感染。近些年來，由于水貂養(yǎng)殖規(guī)模的提高，在山東文登和威海、諸城養(yǎng)殖場發(fā)生了大量水貂混合感染肺炎病例。養(yǎng)殖戶對抗生素亂用，菌株耐藥性不斷增強。致使該病危害程度逐年加深，目前該病已成為危害水貂養(yǎng)殖的主要傳染病之一[3]。

國內(nèi)外針對水貂肺炎疫苗研發(fā)主要從銅綠假單胞菌出發(fā)，往往忽略克雷伯引起的肺炎。本文從克雷伯莢膜多糖作為新型佐劑及其與銅綠假單胞菌制備二聯(lián)苗出發(fā)，通過對小鼠異性抗體水平、抗體水平變化規(guī)律、特異性分泌細(xì)胞的檢測評價，以獲得綜合預(yù)防水貂肺炎二聯(lián)苗，豐富我國水貂肺炎疫苗的種類。

1 材料

1.1 菌株

銅綠假單胞菌強菌株為ZHDL9、肺炎克雷伯強菌株為K7，均由吉林大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫實驗室分離保存。

1.2 試驗動物

6 周齢雌性 SPF 級 Balb/c 小鼠（20±2）g，購自長春憶思實驗動物科技有限公司。

1.3 試劑

BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo 有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)液購自Gbico 公司產(chǎn)品；胎牛血清購自 Hyclone 有限公司；HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 為sigma 公司產(chǎn)品。TMB 顯色液購自天根生化科技有限公司；白細(xì)胞稀釋液購自弘慈醫(yī)療機械有限責(zé)任公司。Biotin-protein A 購自博士德生物有限公司。

2 方法

2.1 克雷伯莢膜多糖的提取、純化

肺炎克雷伯K7 毒株擴大培養(yǎng)，菌液8000r10min 離心、棄上清，加10 倍體積的2dd 水使菌懸浮混勻達(dá)到飽和。置入水浴鍋 55℃以上 30min，靜止一段時間使死菌沉淀。過濾，13000r10min 棄沉淀于終濃度 1%ATCB 吸附。13000r 10min 棄上清融入2MgCL2，13000r 10min 離心棄沉淀。使乙醇終濃度達(dá)到25%離心除核酸，使乙醇終濃度達(dá)到80%離心棄上清得粗糖。融入飽和的乙酸鈉溶液，飽和酚抽提5 次除蛋白，透析去除苯酚。最終至乙醇析出蒸發(fā)后既得精糖。通過硫酸—苯酚法測定莢膜多糖的含量，利用紫外分光光度計進(jìn)行核酸蛋白含量測定，以檢測其純度。

2.2 滅活疫苗的制備

將銅綠假單胞菌強毒株ZHDL9、肺炎克雷伯強毒株K7 活化接種于液體LB 擴大培養(yǎng)，銅綠假單胞菌菌液避光3d，靜止培養(yǎng)。向培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌液、肺炎克雷伯菌液加入終濃度為0.4%甲醛滅活溶液，加入適量無菌的硫代硫酸鈉中和活甲醛，隨后進(jìn)行滅活效果檢驗。既為滅活的銅綠假單胞菌疫苗和克雷伯疫苗；克雷伯莢膜多糖與以滅火銅綠假單胞菌菌體按照一定比例溶解稀釋，即為克雷伯莢膜多糖銅綠假單胞菌菌體疫苗；銅綠假單保菌菌液離心收集上清液滅活加入Al（OH)3膠佐劑旋渦均勻，即為銅綠假單胞菌上清鋁鹽疫苗；滅活的銅綠假單胞菌菌體、滅活克雷伯菌體與Al（OH)3膠佐劑按一定比例溶解，即為銅綠假單胞菌菌體、克雷伯鋁鹽疫苗；滅活克雷伯菌體與Al（OH)3膠佐劑按一定比例溶解，即為克雷伯菌體鋁鹽疫苗。經(jīng)計算小鼠注射抗原量為40ug/只。

2.3 小鼠保護(hù)實驗

將 80 只 Balb/c 小鼠隨機分成 8 組，每組 10 只。分為銅綠假單胞菌培養(yǎng)上清氫氧化鈉吸附組、銅綠假單胞菌體氫氧化鋁組、克雷伯菌體氫氧化鋁組、克雷伯銅綠假單胞菌氫氧化鋁組、克雷伯莢膜多糖組、克雷伯莢膜銅綠假單胞菌菌體組、銅綠假單胞菌菌體組、生理鹽水對照組。每組小鼠進(jìn)行肌肉注射，14d 進(jìn)行二免。二次免疫后 7、14、21d 眼底采血測定抗體水平及其抗體水平變化規(guī)律。

2.4 特異性分泌細(xì)胞的檢測

免疫28d 小鼠眼球取血，400g 離心采集血液，小心棄上清，D-Hanks 洗劑兩遍；400g 離心 5min，重懸細(xì)胞后加入等量的白細(xì)胞稀釋液；400g 離心5min，離心后小心吸取淋巴細(xì)胞至1.5ml 離心管；用RPMI1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為107個/ml，將調(diào)整好細(xì)胞濃度的淋巴細(xì)胞鋪已經(jīng)包被抗原的96 孔Eli-sport 板，每孔 100ul（含 106細(xì)胞）37℃，5%CO2孵育 20h；小心取孔內(nèi)液體無菌PBST 洗5 遍每次 5min；Biotin-proteinA分別 1:1500 倍稀釋后混勻，小心加入 96 孔板中，每孔100ul37℃5%CO2繼續(xù)孵育 40min，無菌 PBST 洗劑 3 遍每次5min，每孔加入 100ulTmb 顯色液，避光顯色 10min，50ul 硫酸終止。細(xì)胞顯微鏡下棕色斑點計數(shù)。結(jié)果通過棕色斑點計數(shù)來判定。

3 結(jié)果與分析

3.1 克雷伯莢膜多糖提取、純化結(jié)果

3.1.1 苯酚—濃硫酸法檢測精糖含量

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1顯示的是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為吸光度值，橫坐標(biāo)是糖的濃度，單位為ug/ml,回歸方程為：y=0.0145x+0.0471,R2=0.942。

由回歸方程計算克雷伯莢膜多糖的含量，結(jié)果見表1，測定3 次莢膜多糖在OD490處的吸收值，取平均值，帶入回歸方程，由回歸方程得到莢膜多糖的濃度為32.68ug/ml，將此濃度代入多糖含量計算公式，得出多糖含量為40.85%。

3.1.2 核酸蛋白檢測儀檢測樣品中蛋白質(zhì)和核酸含量

由表2可知，精致物中蛋白質(zhì)含量大約是0.1%，核酸含量大約是0.08%。證明克雷伯莢膜多糖純化成功，已將大部分蛋白質(zhì)和核酸去除。

3.2 小鼠保護(hù)性實驗結(jié)果

3.2.1 小鼠免疫后抗體變化規(guī)律

對免疫小鼠進(jìn)行采血，通過ELISA 方法測定血清中特異性抗體水平變化規(guī)律。結(jié)果顯示，小鼠免疫后第14 天抗體水平達(dá)到峰值，在第21 天抗體水平開始下降。第14～21 天抗體含量維持在較高水平，見圖2。

表1 多糖含量的測定結(jié)果

表2 蛋白和核酸濃度結(jié)果

圖2 小鼠免疫后抗體水平變化情況

3.2.2 銅綠假單胞菌上清液多組分蛋白疫苗與銅綠假單胞菌菌體疫苗免疫效果比較

將免疫 14、21d 產(chǎn)生抗體小鼠進(jìn)行特異性抗體水平與Elispot 實驗比較結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌上清液疫苗與銅綠假單胞菌菌體疫苗無顯著差異結(jié)果見圖3、4。

3.2.3 莢膜多糖抗原效果評價比較

將免疫14、21d 產(chǎn)生抗體小鼠進(jìn)行特異性抗體水平與Elispot 實驗比較結(jié)果顯示，莢膜多糖抗體水平高于克雷伯菌體，但作為佐劑自身抗原性較低結(jié)果見圖5、6。

3.2.4 克雷伯莢膜多糖作為佐劑對銅綠假單胞菌免疫增強效果的評價

將免疫14、21d 產(chǎn)生抗體小鼠進(jìn)行特異性抗體水平與Elispot 實驗比較結(jié)果顯示，莢膜多糖作為佐劑對銅綠假單胞菌菌體具有增強作用，但產(chǎn)生抗體水平低于氫氧化鋁佐劑結(jié)果見圖7、8。

4 討論

近幾年，我國經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)得到迅猛發(fā)展，但養(yǎng)殖戶的管理理念與管理水平并沒有得到相應(yīng)提高，環(huán)境污染、飼養(yǎng)密度過大、空氣流通不暢、夏季環(huán)境潮濕為銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏桿菌致病菌大量繁殖提供良好的條件。同時也是水貂處于換毛免疫力低下時期，兩種細(xì)菌混合感染制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一。平常無病不免疫，有病亂投醫(yī)、亂治療，致使該菌對多種抗生素耐藥。為該病的藥物治療及預(yù)防帶來極大困難。

目前，國內(nèi)外銅綠假單胞菌疫苗研制主要應(yīng)用人醫(yī)，為基因工程苗、組分疫苗、滅活苗3 大類[3]，對克雷伯引起肺炎不夠重視。莢膜多糖是肺炎克雷伯氏菌莢膜的主要組成部分。莢膜具有高度的親水性、貯存水分、抗干燥是致病菌作為毒力因子重要表面物質(zhì)，國外報道表明，肺炎克雷伯氏菌莢膜多糖對強抗原和弱抗原均有明顯的佐劑作用，但對免疫原性的報道較少。因此，本實驗對莢多膜糖作為佐劑及抗原研究具有重要意義。

本實驗表明，莢膜多糖具有良好的抗原性，作為佐劑自身抗原性較差。莢膜多糖作為佐劑對銅綠假單胞菌菌體抗原具有增強作用。銅綠假單胞菌上清液組分蛋白疫苗與菌體疫苗無顯著差異，且組分蛋白能很好解決地區(qū)血清型的差異性，綜上所述，莢膜多糖作為抗原與銅綠假單胞菌上清液氫氧化鋁膠體制備二聯(lián)苗能很好預(yù)防水貂肺炎的發(fā)生，對控制本病的發(fā)生具有重要意義。

圖3 銅綠假單胞菌上清液疫苗與銅綠假單胞菌菌體疫苗抗體水平比較

圖4 銅綠假單胞菌上清液疫苗與銅綠假單胞菌菌體疫苗特異性細(xì)胞分泌水平比較

圖5 莢膜多糖抗原抗體水平比較

圖6 莢膜多糖抗原特異性細(xì)胞分泌水平比較

圖7 克雷伯莢膜多糖作為佐劑對銅綠假單胞菌抗體水平的評價

圖8 克雷伯莢膜多糖作為佐劑對銅綠假單胞菌特異性細(xì)胞分泌水平比較