閆戰(zhàn)濤

摘要：目的? 探討p16基因表達(dá)與雌激素受體（ER）的相關(guān)性，分析其在ER陰性乳腺癌中的可能應(yīng)用。方法? 選取常州市第一人民醫(yī)院2016年5月～2018年6月手術(shù)治療的乳腺癌石蠟標(biāo)本181例為研究對(duì)象，使用免疫組織化學(xué)（SP法）分別檢測(cè)乳腺癌組織中ER和p16蛋白表達(dá)，分析乳腺癌組織中p16蛋白表達(dá)與ER的關(guān)系及其與不同亞型乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果p16蛋白在ER陽(yáng)性和ER陰性乳腺癌組織中陽(yáng)性率分別為56.19%（59/105）、35.53%（27/76），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;ER陰性乳腺癌中，p16蛋白表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、臨床分期均相關(guān)（P<0.05），與年齡、腫塊大小及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論? p16蛋白表達(dá)的缺失可能主要出現(xiàn)在ER陰性乳腺癌中，上調(diào)抑癌基因p16的表達(dá)有可能作為ER陰性乳腺癌一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，p16蛋白表達(dá)的檢測(cè)也有可能成為ER陰性乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估的一個(gè)參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：p16;ER陽(yáng)性;ER陽(yáng)性;乳腺癌

中圖分類號(hào)：R365? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.10.025

文章編號(hào)：1006-1959（2019）10-0075-03

Abstract：Objective? To investigate the relationship between p16 gene expression and estrogen receptor （ER） and analyze its possible application in ER-negative breast cancer.Methods? A total of 181 paraffin-embedded specimens of breast cancer from the First People's Hospital of Changzhou from May 2016 to June 2018 were selected. Immunohistochemistry （SP method） was used to detect ER and p16 proteins in 181 breast cancer tissues. Expression and analysis of the relationship between p16 protein expression and ER in breast cancer tissues and its relationship with clinical pathological parameters of different subtypes of breast cancer.Results? The positive rates of p16 protein in ER-positive and ER-negative breast cancer tissues were 56.19% （59/105） and 35.53% （27/76）， respectively，the difference was statistically significant （P<0.05）.②In ER-negative breast cancer， p16 protein expression was correlated with lymph node metastasis and clinical stage （P<0.05）， and was not associated with age， mass size and histological grade （P>0.05）.Conclusion? The deletion of p16 protein may be mainly found in ER-negative breast cancer. The up-regulation of p16 expression may be a potential therapeutic target for ER-negative breast cancer. The detection of p16 protein expression may also be a patient with ER-negative breast cancer. A reference indicator for prognostic assessment.

Key words：p16;ER positive;ER positive;Breast cancer

根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達(dá)狀態(tài)可將乳腺癌分為ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌[1]。因乳腺癌具有高度異質(zhì)性，ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌在發(fā)病機(jī)制、臨床病理特征、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面均有很大差異。因此，在越來越追求個(gè)體化治療的今天，進(jìn)一步研究ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌的分子生物學(xué)特征顯得十分必要。抑癌基因p16位于人染色體9p21，屬于周期依賴性激酶抑制因子CDK1家族，其蛋白產(chǎn)物可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值與凋亡和阻止因DNA損傷引起的細(xì)胞增值[2]。目前已經(jīng)證實(shí)p16蛋白在乳腺癌中呈低表達(dá)狀態(tài)[3]，但其在ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌中表達(dá)是否一致尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)181例乳腺癌組織中p16和ER表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)一步分析p16在乳腺癌中的表達(dá)與ER的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1一般資料? 收集常州市第一人民醫(yī)院2016年5月～2018年6月手術(shù)治療的乳腺癌石蠟標(biāo)本181例，經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)全部為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌?；颊呷繛榕裕挲g24～88歲，中位年齡52歲;組織學(xué)分級(jí)（WHO分標(biāo)準(zhǔn)）級(jí)：Ⅰ級(jí)30例、Ⅱ級(jí)87例、Ⅲ級(jí)64例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：62例淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)>3，119例為0～3;臨床分期（TNM）：Ⅰ、Ⅱ合并為112例，Ⅲ為69例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。p16抗體（BS1265，Bioworld公司）;ER單克隆抗體、SP試劑盒（ZA-0102、SP9000，北京中衫金橋公司）。

1.2方法

1.2.1 ER和p16的檢測(cè)? 使用免疫組織化學(xué)染色（SP法），具體步驟為：將5 μm石蠟切片置于65℃烤箱中，過夜孵育;二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，去離子水沖洗5 min，蒸餾水沖洗2遍;采用pH 6.0的檸檬酸溶液進(jìn)行抗原修復(fù);加入100 μl稀釋好的一抗（1∶200稀釋），室溫下孵育1 h，PBS緩沖液沖洗3次;去掉PBS液后，每張切片再加入100 μl稀釋好的二抗（1∶300稀釋），在室溫下孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3次;二氨基聯(lián)苯胺顯色，在顯微鏡下檢驗(yàn)染色質(zhì)量，最后用中性樹膠封片。陰性對(duì)照采用PBS緩沖液代替一抗。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：p16以細(xì)胞核和（或）胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%計(jì)為陽(yáng)性[5]，組織內(nèi)淋巴細(xì)胞或正常的乳腺導(dǎo)管上皮為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照;ER以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥1%計(jì)為陽(yáng)性[6]。

1.2.2 p16蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析? 依據(jù)乳腺癌組織中ER表達(dá)情況將181例樣本分為ER陽(yáng)性組和ER陰性組;分別統(tǒng)計(jì)兩組患者中p16表達(dá)情況、年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等臨床資料。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，采用？字2檢驗(yàn)。乳腺癌組織p16與ER的表達(dá)相關(guān)性使用四格表？字2檢驗(yàn)，ER陽(yáng)性組和ER陰性組中p16表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、組織學(xué)分級(jí)和臨床分期的相關(guān)性使用四格表？字2檢驗(yàn)，ER陽(yáng)性組和ER陰性組中p16表達(dá)與腫塊大小的相關(guān)性使用列聯(lián)表（R×C）？字2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1乳腺癌組織ER和p16蛋白表達(dá)檢測(cè)? 乳腺癌組織細(xì)胞中ER表達(dá)定位于胞核，癌旁組織p16蛋白表達(dá)定位于胞核，乳腺癌組織中p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于胞漿或胞核。181例乳腺癌標(biāo)本中，105例為ER表達(dá)陽(yáng)性，76例為ER表達(dá)陰性;ER陽(yáng)性標(biāo)本中p16蛋白表達(dá)率為56.19%（59/105），ER陰性標(biāo)本p16蛋白表達(dá)率為35.53%（27/76），ER陰性組p16蛋白表達(dá)率低于ER陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2乳腺癌組織p16蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系? 105例ER陽(yáng)性乳腺癌中：p16蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫塊大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)及臨床分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）;在ER陰性乳腺癌中：淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)>3組織中p16蛋白表達(dá)率為17.24%（5/29），淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)為0～3組織中為46.81%（22/47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;臨床Ⅰ+Ⅱ期組織中p16蛋白表達(dá)率為44.00%（22/50），Ⅲ期為19.23%（5/26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;p16蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表2。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有57萬例乳腺癌患者發(fā)生腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]，部分早期乳腺癌患者，也會(huì)發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移[8]。研究根據(jù)乳腺癌標(biāo)志物ER將乳腺癌分為ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌。有研究表明，乳腺癌不同的腫瘤標(biāo)志物可反映其不同的生物學(xué)行為[9]，而且乳腺癌有高度異質(zhì)性，由于乳腺癌ER表達(dá)狀態(tài)的不同，ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌在發(fā)病機(jī)制、臨床病理特征、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面均有很大差異。

乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的病理過程，主要涉及癌基因的激活與抑癌基因的失活。抑癌基因p16是細(xì)胞周期依賴激酶家族抑制蛋白（CKIs）成員之一，可編碼一個(gè)由148個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在限制點(diǎn)（R點(diǎn)）與D型細(xì)胞周期蛋白（cyclinD1）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4/CDK6，抑制CDK4/CDK6的作用，降低Rb蛋白磷酸化水平，從而阻止細(xì)胞通過限制點(diǎn)R點(diǎn)由G1期進(jìn)入S期。因此，當(dāng)p16蛋白不能正常表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，進(jìn)一步引起腫瘤的發(fā)生[10，11]。目前已經(jīng)證實(shí)p16蛋白在乳腺癌中呈低表達(dá)狀態(tài)[3]，但其在ER陽(yáng)性乳腺癌和ER陰性乳腺癌中表達(dá)是否一致尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)181例乳腺癌組織中p16和ER表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)一步分析p16在乳腺癌中的表達(dá)與ER的相關(guān)性。

國(guó)外學(xué)者對(duì)乳腺癌中12種生長(zhǎng)抑制基因的甲基化狀態(tài)和ER及孕激素受體的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p16蛋白表達(dá)和ER表達(dá)無相關(guān)性[12]。Kozomara Z等[13]研究表明，p16蛋白表達(dá)和ER表達(dá)呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步探索p16 蛋白表達(dá)與ER的關(guān)系，本研究用SP法分別檢測(cè)了181例乳腺癌組織中ER和p16 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ER陽(yáng)性標(biāo)本中p16蛋白表達(dá)率為56.19%（59/105），ER陰性標(biāo)本p16蛋白表達(dá)率為35.53%（27/76），ER陰性組p16蛋白表達(dá)率低于ER陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，抑癌基因p16 的表達(dá)可能和ER有關(guān)，p16蛋白表達(dá)的缺失可能主要出現(xiàn)在ER陰性乳腺癌中。

由于乳腺癌的異質(zhì)性以及ER陽(yáng)性和ER陰性乳腺癌患者在臨床病理、治療方法及預(yù)后的不同，我們又分別分析了p16蛋白表達(dá)與ER陽(yáng)性和ER陰性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示ER陽(yáng)性乳腺癌中：p16蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫塊大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)及臨床分期無關(guān)（P>0.05）。但在ER陰性乳腺癌中：淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)>3組織中p16蛋白表達(dá)率為17.24%（5/29），淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)為0～3組織中為46.81%（22/47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），臨床Ⅰ+Ⅱ期組織中p16蛋白表達(dá)率為44.00%（22/50），Ⅲ期為19.23%（5/26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），p16蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)（P>0.05）?？梢?，p16蛋白表達(dá)可能只與ER陰性乳腺癌臨床病理參數(shù)有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期是乳腺癌治療和預(yù)后評(píng)估的重要參考，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ER陰性組中p16蛋白表達(dá)率在淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)>3和臨床Ⅲ期中，分別明顯低于淋巴結(jié)（腋窩）轉(zhuǎn)移數(shù)為0～3和臨床Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），因此抑癌基因p16有可能作為ER陰性乳腺癌一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，p16蛋白表達(dá)的檢測(cè)也有可能成為ER陰性乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估的一個(gè)參考指標(biāo)。

綜上所述，p16蛋白表達(dá)的缺失可能主要出現(xiàn)在ER陰性乳腺癌中，上調(diào)抑癌基因p16的表達(dá)有可能作為ER陰性乳腺癌一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，p16蛋白表達(dá)的檢測(cè)也有可能成為ER陰性乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估的一個(gè)參考指標(biāo)，但尚需在更多樣本上的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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收稿日期：2019-2-20;修回日期：2019-3-7

編輯/成森