孫照剛 張洪靜 李自慧 孫琦 呂琳娜 潘麗萍 Sandy Gilbert 張宗德 許紹發(fā) James Xia

結(jié)核病，尤其是耐藥結(jié)核病的快速和全面診斷需求迫切。目前，結(jié)核病的分子生物學(xué)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，諸如線性探針技術(shù)、GeneXpert MTB/RIF技術(shù)、熔解曲線檢測(cè)技術(shù)及芯片檢測(cè)技術(shù)相繼出現(xiàn)。耐藥結(jié)核病基因芯片檢測(cè)是WHO認(rèn)可的用于結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性檢測(cè)的分子生物學(xué)方法[1]。包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)研發(fā)了不同的MTB耐藥檢測(cè)基因芯片[2-5]。目前，用于MTB耐藥性檢測(cè)的基因芯片基本都是基于核酸雜交原理的第一代基因芯片技術(shù)。本研究將報(bào)道具有快速、方便和精準(zhǔn)等特點(diǎn)的新一代基于微測(cè)序原理的基因芯片技術(shù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌株來(lái)源：MTB實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)和109株臨床分離菌株均來(lái)自于北京結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫(kù)。

2.儀器和試劑：(1)主要儀器：普通PCR儀(杭州博日科技有限公司)、原位PCR儀(杭州博日科技有限公司)、芯片掃描儀[Agilent G5761A；安捷倫科技(中國(guó))有限公司]等。(2)主要試劑：Dnase Ⅰ(美國(guó)Sigma公司)、測(cè)序酶(美國(guó)GE Healthcare公司)、Biotin-NTPs(美國(guó)Life Sciences公司)、Streptavidin-Alexa 647粉末(美國(guó)Life Sciences公司)等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.表型藥敏試驗(yàn)：MTB臨床分離株的培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法，用MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)進(jìn)行質(zhì)量控制。藥敏試驗(yàn)采用絕對(duì)濃度法，試驗(yàn)藥物為異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)、氧氟沙星(Ofx)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)，試驗(yàn)濃度：INH 1、10 μg/ml；RFP 50、250 μg/ml；Sm 10、100 μg/ml；EMB 5、50 μg/ml；Ofx 2、10 μg/ml；Am 30、100 μg/ml；Cm 40、100 μg/ml[6]。

2.DNA提?。翰捎没蚪MDNA小量提取試劑盒(德國(guó)凱杰公司)，按照操作說(shuō)明書(shū)對(duì)復(fù)蘇培養(yǎng)的菌株進(jìn)行溶菌酶消化菌體和蛋白酶K消化組蛋白等雜蛋白步驟，最后采用核酸吸附柱將基因組DNA吸附在柱子的膜上，最后用水洗脫用作PCR反應(yīng)模板。為了便于驗(yàn)證臨床菌株中稀有出現(xiàn)的密碼子突變，筆者還設(shè)計(jì)合成了17個(gè)包含MTB基因組稀有突變的質(zhì)粒。

3.PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道的PCR所用的引物和條件進(jìn)行耐藥基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的測(cè)序采用每個(gè)基因單獨(dú)擴(kuò)增后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。用于芯片檢測(cè)的PCR產(chǎn)物根據(jù)文獻(xiàn)[7]采用兩管擴(kuò)增8個(gè)基因的方法進(jìn)行多重PCR測(cè)定。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(德國(guó)凱杰公司)純化PCR產(chǎn)物，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4.芯片的設(shè)計(jì)和制備：根據(jù)筆者獲得批準(zhǔn)的專利(批準(zhǔn)號(hào)：201510033001.0)設(shè)計(jì)相應(yīng)的芯片。首先根據(jù)待檢測(cè)的突變位點(diǎn)和形式在突變兩側(cè)設(shè)計(jì)反向和正向探針序列，并進(jìn)行探針合成；之后，將探針的5′端固定在固相介質(zhì)——玻璃生物芯片上，3′端終止在基因多態(tài)性位點(diǎn)。如果與被檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)配，引物就不會(huì)延伸擴(kuò)增，如果恰好能夠與被檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)吻合則引物擴(kuò)增會(huì)順利進(jìn)行，從而顯示熒光信號(hào)。

5.芯片檢測(cè)：(1)PCR產(chǎn)物酶解：取0.2 μl DNase Ⅰ工作液(0.1 U/μl)，加入到20 μl所有 PCR純化產(chǎn)物的混合物中，37 ℃處理10 min，95 ℃處理10 min。(2)芯片檢測(cè)：將chamber膠面與芯片正面貼合在一起，放入平板擴(kuò)增儀中，90 ℃處理2 min。將含有生物素標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)、測(cè)序酶和PCR混合產(chǎn)物的芯片反應(yīng)液從加樣孔中注入芯片槽內(nèi)，采用85 ℃退火和60 ℃延伸反應(yīng)的條件循環(huán)擴(kuò)增8次。芯片反應(yīng)結(jié)束后，從基因擴(kuò)增儀中取出芯片，置于60 ℃芯片洗滌液中，保持芯片正面向上，在洗滌液中洗滌30 min。之后在超純水中，室溫洗滌3次。將芯片置于Streptavidin-Alexa 647染色液染色，重復(fù)脫色，最后加入超純水繼續(xù)洗滌2次，甩干后進(jìn)行全芯片掃描。

6.芯片結(jié)果的判讀：本研究是創(chuàng)新性探索研究，沒(méi)有相應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果處理軟件，故而采用人工計(jì)算的方法。在同一張芯片的隨機(jī)物理位置上點(diǎn)制同一種檢測(cè)探針，因此每個(gè)標(biāo)本可被重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值。陽(yáng)性標(biāo)本的熒光值是陰性標(biāo)本(或者對(duì)照水標(biāo)本)熒光值的2倍以上即判斷為陽(yáng)性。以測(cè)序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算芯片檢測(cè)結(jié)果的符合率，計(jì)算公式：與測(cè)序結(jié)果相同的芯片檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量/該位點(diǎn)總的檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量×100%。對(duì)于同一個(gè)基因存在多個(gè)位點(diǎn)的不同突變形式，只要有1個(gè)判斷為突變陽(yáng)性，則定義為該基因檢測(cè)陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以測(cè)序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算芯片檢測(cè)方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和一致性。兩種方法的一致性用Kappa檢驗(yàn)，K<0.4,認(rèn)為一致性較差；0.4≤K<0.75，認(rèn)為一致性一般；K≥0.75，認(rèn)為一致性較好。

結(jié) 果

一、耐藥基因序列測(cè)定

109株MTB臨床分離株各耐藥基因的突變形式和數(shù)目見(jiàn)表1。所有經(jīng)表型藥敏試驗(yàn)確定為相應(yīng)抗結(jié)核藥物耐藥的菌株在本研究中檢測(cè)的耐藥相關(guān)基因中均存在至少1個(gè)有義堿基突變。

表1 109株MTB臨床分離株的耐藥相關(guān)基因突變情況

續(xù)表1

注表中C、T、A、G分別為胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的縮寫(xiě)。a:表示尚未找到適合的突變檢測(cè)探針

二、微測(cè)序耐藥基因芯片探針的整體設(shè)計(jì)

在前期驗(yàn)證探針設(shè)計(jì)和芯片檢測(cè)正確的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)包括katG、inhA啟動(dòng)子區(qū)、rpoB、gyrA、embB、rpsL、rrs和eis基因的目前已報(bào)道的所有突變位點(diǎn)的全部已知突變形式，共計(jì)220條探針。其中，包含katG基因2個(gè)堿基位點(diǎn)的4種突變形式，inhA啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)位點(diǎn)的2種突變形式，rpoB基因的7個(gè)位點(diǎn)的14種突變形式，gyrA基因的6個(gè)位點(diǎn)的9種突變形式，embB基因7個(gè)位點(diǎn)的16種突變形式，rpsL基因3個(gè)位點(diǎn)的6種突變形式，rrs基因3個(gè)位點(diǎn)的4種突變形式，eis基因3個(gè)位點(diǎn)的3種突變形式。經(jīng)過(guò)在35株MTB臨床分離株和突變合成質(zhì)粒中初步的基因芯片探針驗(yàn)證，確定了其中67條效果較好的探針作為進(jìn)行MTB耐藥突變檢測(cè)的最終基因芯片探針組合。但是仍然有6種突變形式需要進(jìn)一步優(yōu)化其探針，這些探針?lè)謩e用來(lái)檢測(cè)eis基因的-14位點(diǎn)、gyrA基因94位點(diǎn)(GAC)的AAC和TTC突變形式和embB基因306位點(diǎn)(ATG)的GTC、TTA和AGC突變形式。

三、微測(cè)序耐藥基因芯片各探針的檢測(cè)效果

基于前期篩選到的優(yōu)秀突變檢測(cè)探針，制備了包含有67條探針的MTB耐藥突變檢測(cè)基因芯片，檢測(cè)的突變位點(diǎn)和突變形式見(jiàn)表2。本研究初步對(duì)109株臨床分離株采用該芯片進(jìn)行了突變檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果證明：除檢測(cè)embB基因突變的2條探針(embB_1489-90_S_CA和embB_916-8_A_CAT)外，與測(cè)序結(jié)果相比，其余65條探針在檢測(cè)堿基突變形式方面的符合率均超過(guò)了95%，其中42條探針的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果符合率達(dá)到了100.00%。

表2 選擇出的67條探針檢測(cè)109株MTB臨床分離株相應(yīng)耐藥位點(diǎn)的堿基突變情況

續(xù)表2

注a：表示109株MTB臨床分離株中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變。探針名稱命名原則為：基因名稱_突變位點(diǎn)_正(S)反(A)向_堿基，例如：eis_-10_S_G，表示在eis基因的-10位點(diǎn)(啟動(dòng)子區(qū))的正向檢測(cè)堿基G的探針；而embB_126-8_A_TCG則表示在embB基因126～128位點(diǎn)上檢測(cè)3個(gè)堿基TCG的反向探針(正向序列為CGA)；“符合率”指基因芯片檢測(cè)結(jié)果與表1中的測(cè)序結(jié)果相比所能達(dá)到的符合率

四、總體耐藥基因突變檢測(cè)效果分析

表2列出的是每個(gè)耐藥突變位點(diǎn)的檢出情況，涉及MTB的8個(gè)耐藥相關(guān)基因。由于每個(gè)基因涉及多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)，只有將表1中同一耐藥相關(guān)基因的所有突變位點(diǎn)進(jìn)行整體描述才能判斷本研究設(shè)計(jì)的芯片在基因水平上的檢測(cè)效果。分別以每個(gè)耐藥基因作為一個(gè)整體來(lái)看，以測(cè)序結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)對(duì)embB基因、gyrA基因、inhA基因、katG基因、rpoB基因、rpsL基因、eis基因和rrs基因突變檢測(cè)的敏感度分別為64.21%(61/95)、80.00%(8/10)、95.83%(23/24)、98.55%(68/69)、92.63%(88/95)、93.85%(61/65)、75.00%(3/4)和94.44%(17/18)；特異度分別為92.86%(13/14)、100.00%(99/99)、97.65%(83/85)、87.50%(35/40)、85.71%(12/14)、63.64%(28/44)、100.00%(105/105)和98.90%(90/91)?；蛐酒瑱z測(cè)gyrA基因、inhA基因、katG基因、eis基因和rrs基因的效能與基因測(cè)序具有高度的一致性；檢測(cè)rpoB基因和rpsL基因的效能與基因測(cè)序的一致性中等；檢測(cè)embB基因的效能與基因測(cè)序的一致性一般(表3)。

討 論

耐藥結(jié)核病的快速診斷和高通量診斷是目前技術(shù)研發(fā)的方向和趨勢(shì)。目前較為成熟的MTB快速耐藥檢測(cè)技術(shù)是GeneXpert MTB/RIF技術(shù)。典型的高通量耐藥檢測(cè)技術(shù)當(dāng)屬基因芯片技術(shù)[8]。受傳統(tǒng)芯片雜交檢測(cè)法的技術(shù)限制，目前的耐藥基因芯片檢測(cè)的只有INH和RFP兩種藥物，檢測(cè)的藥物種類(lèi)不多，未能充分發(fā)揮基因芯片檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[9]。因此，筆者課題組研究和開(kāi)發(fā)了新一代耐藥基因芯片檢測(cè)技術(shù)——微測(cè)序基因芯片。該技術(shù)類(lèi)似于在芯片的原位位點(diǎn)上進(jìn)行測(cè)序，因此具有快速和精準(zhǔn)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。

基因芯片用于結(jié)核病的檢測(cè)已經(jīng)顯示出較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，主要的應(yīng)用領(lǐng)域集中在MTB的耐藥性檢測(cè)和菌種鑒定方面。其基本檢測(cè)原理是檢測(cè)MTB的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)?；蛐酒ㄟ^(guò)檢測(cè)MTB抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因的堿基突變來(lái)確定其耐藥性[10]；利用各分枝桿菌菌種之間高度保守的DNA同源序列具有一定程度的序列差異的特點(diǎn)進(jìn)行菌種鑒定，檢測(cè)的靶基因主要包括16S核糖體DNA(16S rDNA)轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列(internal transcribed spacer, ITS)、熱休克蛋白65(hsp65)、RNA聚合酶亞基(rpoB)等同源序列[11-15]?；蛐酒瑱z測(cè)存在操作程序略顯復(fù)雜和所需設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)，加之檢測(cè)標(biāo)本中非結(jié)核分枝桿菌感染所占比例較低，因而菌種鑒定芯片的使用目前尚沒(méi)有被廣泛采用。在我國(guó)，基因芯片已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于MTB耐藥性檢測(cè)，在多種類(lèi)型結(jié)核病檢測(cè)中得到應(yīng)用，如初治和復(fù)治肺結(jié)核[16]、塵肺并發(fā)肺結(jié)核[17]和骨結(jié)核[18]等。因此，筆者首先將微測(cè)序基因芯片技術(shù)用于耐藥結(jié)核病的檢測(cè)領(lǐng)域。

表3 以基因測(cè)序結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)基因芯片檢測(cè)MTB耐藥基因突變的檢測(cè)效能

注表中括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“95%CI值”

本研究首先采用少量MTB基因突變位點(diǎn)進(jìn)行芯片的設(shè)計(jì)和確立檢測(cè)流程，結(jié)果顯示，初期設(shè)計(jì)的微測(cè)序耐藥基因檢測(cè)芯片具有很好的檢測(cè)效果，與測(cè)序結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)8個(gè)基因的所有突變形式進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)探針的優(yōu)化和篩選后，最終得到67條探針用于芯片的制備。對(duì)制備好的芯片進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明除embB基因外，該芯片具有良好的檢測(cè)性能，各耐藥基因的檢出率均達(dá)到或超過(guò)95%，達(dá)到或超過(guò)目前應(yīng)用的耐藥基因檢測(cè)芯片的檢出率[2-5]。本研究設(shè)計(jì)制備的芯片不但容納了臨床分離株中幾乎全部突變(包括稀有的耐藥基因突變)，而且能夠清楚地表明突變位點(diǎn)和突變形式，可以用于精確的科學(xué)研究。

為了充分顯示微測(cè)序芯片的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，本研究對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩者具有高度的一致性。但是靶基因測(cè)序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在表型耐藥的菌株中至少能發(fā)現(xiàn)其相關(guān)耐藥基因中的1個(gè)突變位點(diǎn)，表型耐藥和基因型耐藥顯示出高度的一致性。造成這一現(xiàn)象的原因很可能與本研究所選實(shí)驗(yàn)菌株有關(guān)。為了能夠使微測(cè)序基因芯片上有足夠多的耐藥突變形式得到充分驗(yàn)證，降低驗(yàn)證成本，筆者所選實(shí)驗(yàn)菌株主要以耐多藥MTB為主。但是這并不影響本研究所要達(dá)到的目的。同時(shí)，本研究也沒(méi)有對(duì)微測(cè)序耐藥基因芯片的耐藥性檢測(cè)結(jié)果與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

本研究將所有8個(gè)基因的所有突變形式進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，不可避免地出現(xiàn)了個(gè)別探針難以找到合適的探針序列的現(xiàn)象。其原因歸根結(jié)底是由突變堿基位點(diǎn)兩側(cè)的核酸序列決定的，但是也可能與該突變位點(diǎn)突變形式多樣，而且決定該位點(diǎn)氨基酸的三聯(lián)體密碼子同時(shí)發(fā)生兩個(gè)以上的突變有關(guān)。因此，在進(jìn)一步的研究中，對(duì)這類(lèi)聯(lián)合突變將采用逐個(gè)組合的方式進(jìn)一步優(yōu)化并得到適合的探針。另外，鑒于基因芯片檢測(cè)操作流程的復(fù)雜性，今后還需進(jìn)一步優(yōu)化技術(shù)操作流程，縮短檢測(cè)時(shí)間，以便及時(shí)為臨床提供準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。