付 躍， 柳雨珠， 韋秋艷， 何 麟， 秦文芳， 張玉蘭， 覃擁靈*

(1.河池學院 化學與生物工程學院， 廣西 宜州 546300； 2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室， 廣西 宜州 546300)

纖維素是由葡萄糖組成的、不溶于水及一般有機溶劑的大分子多糖，是植物細胞壁的主要組成成分，占植物有機成分的35%～50%，是地球上分布最廣泛最豐富的碳水化合物，也是一種可再生資源，全球每年通過光合作用產生的纖維素達20億t。纖維素降解是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)[1]，纖維素降解不僅可以將農副產品和工業(yè)廢料中的纖維素材料轉化為糖，為飼料行業(yè)、發(fā)酵工業(yè)和人類食品提供新的原料來源，同時還可以處理廢物、消除公害、保護環(huán)境[2]。自然界中微生物降解纖維素往往是多種微生物產生多種酶組分，如內切型和外切型葡聚糖水解酶、β-葡萄糖苷酶(β-G)等協(xié)同作用才能完成[3-4]；而產生纖維素降解酶的混合菌一般為2～3種[5-6]。研究表明，微生物中的大多數(shù)真菌可產生纖維素酶，如青霉屬、曲霉屬和木霉屬等[7-9]。國內外利用木霉生產的纖維素酶雖然含有高活力的葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶，但β-葡萄糖苷酶酶活低，致使酶水解液中纖維素二糖或其他可溶性纖維寡糖積累，并強烈反饋抑制內切型和外切型葡聚糖水解酶的催化活性[10]。由于天然纖維素酶酶活較低、成本高(占酶糖化纖維材料總成本的25%～50%)，致使纖維素酶應用受限[7]，如用木質纖維素工業(yè)化生產燃料乙醇的途徑至今仍不能真正實現(xiàn)。因此，開發(fā)新的纖維素酶資源，尋找高活性纖維素酶產生菌和新的發(fā)酵方法已成為該領域的研究熱點[11-13]。

米曲霉被廣泛應用于發(fā)酵食品(如醬油和清酒等)領域[14]，且被世界衛(wèi)生組織列為安全菌株[15]。曲霉產的β-葡萄糖苷酶活性高，其與木霉產纖維素酶按適合比例搭配使用可有效提高纖維素的降解效率。張林等[16]研究表明，米曲霉產生的纖維素酶中β-葡萄糖苷酶活性高，可以將內切型葡聚糖水解酶、外切型葡聚糖水解酶作用纖維素之后產生的纖維二糖或可溶性的纖維寡糖水解成葡萄糖分子并消除纖維二糖對內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反饋作用；有些β-葡萄糖苷酶能以葡萄糖為底物合成龍膽二糖或龍膽三糖，龍膽二糖可誘導其他菌種分泌纖維素酶。所以將綠色木霉與產β-葡萄糖苷酶高的米曲霉進行混合培養(yǎng)對彌補綠色木霉中β-葡萄糖苷酶活力的不足、改進整個纖維素酶的酶系結構，進而有效降解纖維素具有重大意義。鑒于此，筆者采用單因素試驗和正交試驗的方法研究綠色木霉和米曲霉進行混合固體發(fā)酵產纖維素酶，旨在為提高纖維素降解效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種綠色木霉(Trichodermaciride)和米曲霉(Aspergillusoryzae)均保存于微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室。

1.1.2 儀器YM50型不銹鋼智能型立式電熱蒸氣消毒器、GNP-910BS-Ⅲ型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-1FD型潔凈工作臺、CS101-AB型電熱鼓風干燥箱、AE240S型電子分析天平、DK2-1型電熱恒溫震蕩水糟、棱光牌722N可見分光光度器、SHA-C型水浴恒溫振蕩器、BCD-226STC冰箱冷凍離心機、HH-6恒溫水浴鍋、11020型電子天平、SHA-C型水浴恒溫振蕩器及CS101-2AB型電熱鼓風干燥箱。

1.1.3 試劑葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫、硫酸鎂、硫酸銨、無水亞硫酸鈉、四水合酒石酸鉀鈉(酒石酸鉀鈉)、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、瓊脂、苯酚、醋酸鈉、冰醋酸及氫氧化鈉等均為分析純，市購。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

1) 米曲霉和綠色木霉的培養(yǎng)。米曲霉和綠色木霉甘油種保存于-80℃的低溫冰箱中。取出在無菌超凈工作臺中分別將菌種接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。用10 mL生理鹽水將活化培養(yǎng)的綠色木霉菌株和米曲霉菌株分別制成1×107個/mL孢子懸浮液或單細胞菌懸液，各取1 mL分別接于100 mL液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min培養(yǎng)3 d備用。

2) 米曲霉和綠色木霉單菌株發(fā)酵產酶。分別將綠色木霉液體種子、米曲霉液體種子各2.5 mL接入裝量為25 mL/300 mL的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d后取出，按20∶1(V∶W，mL∶g)加入蒸餾水，40℃恒溫水浴1 h，8層紗布過濾，6 000 r/min離心10 min，取上清液即粗酶液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制作參照文獻[17]的方法分別吸取0.1%葡萄糖標準液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.5 mL置于1～8號比色管中，用蒸餾水補充至1.5 mL，再加2 mL DNS試劑，充分混合后在沸水中煮沸10 min。冷卻后用蒸餾水定容至12.5 mL。用分光光度儀于540 nm處測OD值，以1號管為對照。葡萄糖標準樣的制備見表1，以葡萄糖的mg數(shù)為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

表1葡萄糖濃度標準樣的制備

Table 1 Preparation of the standard samples of glucose concentration

項目Item1(CK)2345678葡萄糖含量/mg 00.20.40.60.811.21.5 Glucose contentDNS/mL22222222OD值 OD value00.2750.5340.7861.0161.3001.5351.847

1.2.3 不同因素對混合固體發(fā)酵產纖維素酶酶活的影響

1) 混合菌種的接種量比。設4個處理，即在保持混合種子液接種量10%不變的情況下，按米曲霉種子液與綠色木霉種子液體積百分比分別為0與100%，33%與67%，50%與50%，67%與33%，分別接種于裝量為25 mL/300 mL的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d。每個處理3個平行。重復1.2.2的方法制取粗酶液備用測酶活力(下同)，確定最佳混合菌種的接種量比。

2) 麩皮質量占比。以甘蔗渣為主要碳源，麩皮有利于菌種在初始階段對碳源的有效利用，為此選擇適當?shù)母收嵩c麩皮比例對纖維素酶產量非常重要。保持固體發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮和甘蔗渣總質量為8 g/25 mL不變。設4個處理，其中，麩皮質量占比依次為20%、22%、25%和29%，其余為甘蔗渣質量比。吸取2種霉種子液各2.5 mL接種于裝量為25 mL/300 mL的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d后制取粗酶液測酶活力，確定最佳麩皮與甘蔗渣質量比。每個處理3個平行。

3) 裝量。由于綠色木霉和米曲霉均屬于好氧菌株，因此，裝量大小對發(fā)酵產酶量有影響。根據錐瓶裝量(容積)設4個處理，即100 mL、250 mL、300 mL和500 mL，每個處理分別加入25 mL固體發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接入2種霉種子液各2.5 mL，于28℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d后制取粗酶液測定酶活力，確定裝量對酶活的影響。每個處理3個平行。

4) 培養(yǎng)時間。裝量為25 mL/300 mL的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2種霉種子液各2.5 mL，28℃發(fā)酵培養(yǎng)，分別在發(fā)酵3 d、4 d、5 d和6 d時制取粗酶液測定酶活力，確定最佳發(fā)酵時間。每個處理3個平行。

5) 混合固體發(fā)酵產纖維素酶最佳發(fā)酵條件的篩選。在單因素試驗基礎上進行L9(34)正交試驗，篩選混合菌固體發(fā)酵產纖維素酶的最佳發(fā)酵條件。

1.2.4 酶活測定在pH 4.8，溫度50℃下，每1 mL纖維素酶液在1 min內能水解底物生成1 mg的葡萄糖，稱為1個酶活單位(U)[18-20]。

1) 羧甲基纖維素(CMC)酶。將1 mL 1%(W/V)CMC-Na置于50℃的水浴鍋中預熱5 min，加入0.5 mL粗酶液，50℃保溫反應30 min；然后立即加入3 mL的DNS試劑，用去離子水定容至25 mL體積，沸水浴5 min，用自來水冷卻至室溫，在540 nm處測吸光值，依據葡萄糖標準曲線計算反應產生的葡萄糖濃度并計算酶活。

2) 濾紙(FPA)酶活。取粗酶液0.5 mL，以50 mg新華濾紙條為底物，加1.5 mL醋酸緩沖液(pH 4.8)50℃恒溫反應60 min，后續(xù)測定同上。

3)β-葡萄糖苷酶(β-G)酶。取粗酶液0.5 mL，加入1 mL 1%的水楊苷溶液，再加入0.5 mL pH 4.8的醋酸緩沖液，50℃恒溫反應30 min，后續(xù)測定同上。

1.3 數(shù)據統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據用Excel進行處理。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

從圖1可見，葡萄糖標準樣的濃度與其在540 nm處的吸光度(OD值)之間存在線性關系，其線性回歸方程為y=1.295 1x+0.005 1，R2=0.999 2，說明，二者間線性關系良好。

圖1葡萄糖標準曲線

2.2 綠色木霉和米曲霉單菌種固體發(fā)酵產酶的酶活性

由圖2可知，綠色木霉和米曲霉單菌種固體發(fā)酵產酶的酶活存在差異。其中，米曲霉產β-葡萄糖苷酶活性較高，是綠色木霉的1.45倍；其羧甲基纖維素(CMC)酶酶活是綠色木霉的1.175倍；綠色木霉濾紙酶(FPA)酶活是米曲霉的1.30倍。纖維素的降解是多種酶混合作用的結果，F(xiàn)PA酶活反應纖維素酶系的綜合酶活力，當進行混合發(fā)酵降解纖維素時，綠色木霉能夠分泌高活性的葡聚糖內切酶和葡聚糖外切酶，此2種酶將纖維素降解為纖維二糖。接種米曲霉后，分泌高活性的β-葡萄糖苷酶，將纖維二糖降解為葡萄糖，解除對內切酶和外切酶的抑制作用?；旌暇N發(fā)酵較單菌種發(fā)酵降解纖維素的效果更好。

圖2綠色木霉和米曲霉單菌株發(fā)酵產酶的酶活性

2.3 不同因素處理混合菌固體發(fā)酵產纖維素酶的活性

從圖3看出，不同因素處理綠色木酶和米曲霉2種菌種混合固體發(fā)酵產纖維素酶的酶活性存在差異。

2.3.1 混合菌種的接種量比混合菌固體發(fā)酵產各酶類的酶活大小隨米曲霉種子液體積百分比增加均呈先升后降趨勢，且各處理濾紙酶活、羧甲基纖維素酶活及β-葡萄糖苷酶的酶活力均表現(xiàn)為CMC>β-G>FPA。其中，當米曲霉種子液體積百分比為50%，即米曲霉與綠色木霉種子液接種量比為1∶1時，2種菌種混合固體發(fā)酵產FPA、CMC及β-G的酶活力均高于單種菌株產酶的酶活力，此時FPA、CMC及β-G的酶活分別為5.98 U/ml、16.50 U/mL和12.30 U/mL。究其原因是米曲霉產生的β- G酶活性較高，將葡聚糖內切酶和葡聚糖外切酶產生的纖維二糖降解為葡萄糖，解除纖維二糖對葡聚糖內切酶和葡聚糖外切酶的反饋抑制作用。

2.3.2 麩皮與甘蔗渣質量比混合菌固體發(fā)酵產各酶類的酶活大小隨麩皮質量百分比增加均呈先升后降趨勢，且各處理的酶活力均表現(xiàn)為CMC>β-G>FPA。當麩皮質量百分比為25%，即麩皮與甘蔗渣質量比為1∶3時酶活較高，此時FPA、CMC和β-G的酶活分別為6.5 U/mL、20.2 U/mL和14.53 U/mL。

2.3.3 裝量混合菌固體發(fā)酵產各酶類的酶活大小隨錐瓶裝量增加均呈先升后降趨勢，且各處理的酶活力均表現(xiàn)為CMC>β-G>FPA。其中，當裝量為25 mL/300 mL時各酶類的酶活均達最高， FPA、CMC及β-G的酶活分別為7.84 U/mL、19.46 U/mL和15.98 U/mL。說明，裝量的大小影響溶氧量，從而影響酶的合成。

2.3.4 培養(yǎng)時間混合菌固體發(fā)酵產各酶類的酶活大小隨培養(yǎng)時間均呈先升后降趨勢，且各處理的酶活力均表現(xiàn)為CMC>β-G>FPA。其中，2種菌種混合發(fā)酵4 d時各酶類的酶活均達最高， FPA、CMC及β-G的酶活分別為6.72 U/mL、21.22 U/mL和15.93 U/mL。

圖3 不同因素處理混合固體發(fā)酵濾紙酶(FPA)、羧甲基纖維素酶(CMC)及β-葡萄糖苷酶(β-G)的酶活性

2.4 2種菌種混合固體發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件

在單因素試驗基礎上選取米曲霉種子液占比、麩皮質量占比、三角瓶體積和發(fā)酵時間進行L9(34)正交試驗設計(表2)。從表2和表3可知，影響濾紙酶活的主要因素依次是三角瓶體積>發(fā)酵時間>米曲霉種子液占比>麩皮質量占比，其最優(yōu)發(fā)酵條件為米曲霉種子液占比65%，麩皮質量占比30%，三角瓶體積300 mL，發(fā)酵時間4.5 d；影響羧甲基纖維素酶酶活性的主要因素依次是米曲霉種子液占比>發(fā)酵時間>三角瓶體積>麩皮質量占比，其最佳發(fā)酵條件為米曲霉種子液占比50%，麩皮質量占比25%，三角瓶體積500 mL，發(fā)酵時間4 d；影響β-葡萄糖苷酶的主要因素依次為發(fā)酵時間>麩皮質量占比>米曲霉種子液占比>三角瓶體積，其最佳發(fā)酵條件為米曲霉種子液占比50%，麩皮質量占比25%，三角瓶體積500 mL，發(fā)酵時間4 d。綜上，選擇最佳發(fā)酵條件為米曲霉種子液占比50%，麩皮質量占比25%，三角瓶體積500 mL，發(fā)酵時間4 d進行驗證試驗，結果表明，F(xiàn)PA、CMC及β-G的酶活分別為5.234 U/mL、22.46 U/mL和16.38 U/mL。

表2 綠色木霉和米曲霉混合固體發(fā)酵產纖維素酶的L9(34)正交試驗

表3 綠色木霉和米曲霉混合固體發(fā)酵產纖維素酶的L9(34)正交試驗的均值與極差

注：k1、k2、k3分別為各因素在1、2、3水平時產酶量；R為極差。

Note:k1，k2andk3are the enzyme production with factors at 1, 2 and 3 levels, respectively;Ris the range.

3 結論與討論

研究結果表明，米曲霉與綠色木霉混合菌固體發(fā)酵產纖維素酶的最佳發(fā)酵條件：綠色木霉和米曲霉的接種比例為1∶1、裝量為25 mL/500 mL錐形瓶、麩皮與甘蔗渣質量比為1∶3、發(fā)酵時間為4 d。在此條件下，濾紙酶活、羧甲基纖維素酶活、β-葡萄糖苷酶酶活分別為5.234 U/mL、22.46 U/mL和16.38 U/mL，均高于單菌種發(fā)酵。楊林麗[21]篩選纖維素酶產生菌，得到12株菌種，通過拮抗試驗舍棄一株，將剩下菌種進行混合發(fā)酵，秸稈失重率均高于單一菌種發(fā)酵，說明混合菌種發(fā)酵能有效提高纖維素酶產量。

混合菌固體發(fā)酵產纖維素酶的酶活性高于2種菌種單獨發(fā)酵的纖維素酶酶活性。說明，混合菌發(fā)酵可促使菌種間產酶的協(xié)同作用，提高纖維素酶產量及活性。其原因是內切酶和外切酶作用纖維素產生纖維寡糖，高活性β-葡萄糖苷酶能夠將纖維寡糖水解成單糖，解除對葡聚糖內切酶和葡聚糖外切酶的抑制，有的β-葡萄糖苷酶能夠將生成的過量單糖轉化為龍?zhí)炼腔螨埬懭牵瑯咏獬咸烟菍γ傅囊种啤?/p>

該研究以固體培養(yǎng)基發(fā)酵為基礎，通過單因素及正交試驗方法對混合菌種發(fā)酵進行研究，摸索混合菌種最適發(fā)酵條件，為其他混合菌種發(fā)酵指明了方向。