馬溢聰 徐文飛 劉鳳 李旭輝

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是臨床上一種常見 的慢性骨關(guān)節(jié)退行性疾病，并且隨著年齡的增長發(fā)病概率逐漸升高。OA的基本特征為多種原因引起的軟骨細胞降解。在疾病的早期發(fā)生過程中，白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎性細胞因子能夠通過調(diào)控Nuclear factor kappa-B（NF-κB）、Mitogen-activated protein kinase（MAPK）等信號通路促進炎癥反應(yīng)的進行［1］。而在OA的發(fā)展過程中，軟骨細胞的過度凋亡成為疾病加重的另一個重要原因［2］。Bcl-xl（B-cell lymphoma-extralarge）和Survivin是兩個拮抗細胞凋亡的信號分子，當(dāng)拮抗細胞凋亡的蛋白表達受到抑制后，會影響細胞正常的生命活動，引起細胞過度凋亡［3，4］。近年來，硫酸軟骨素（chondroitin sulfate,CS）作為一種新型的關(guān)節(jié)軟骨保護劑在臨床上發(fā)揮了較好的治療效果，能明顯減輕OA病人骨關(guān)節(jié)疼痛并改善骨關(guān)節(jié)功能［5］。鯊魚軟骨粉含有豐富的硫酸軟骨素及其他多糖類物質(zhì)，臨床上有鯊魚軟骨素制劑有效改善OA病人關(guān)節(jié)疼痛、減少病情反復(fù)發(fā)作的實例［6］，但作用機制尚不明確。本研究通過體外培養(yǎng)人正常軟骨細胞C28/I2，觀察鯊魚軟骨粉對細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響，探討鯊魚軟骨粉保護軟骨細胞的可能機制。

材料與方法

一、實驗細胞、藥品、試劑及實驗儀器

人正常軟骨細胞C28/I2購于上海鈺博生物科技有限公司（中國）。鯊魚軟骨粉（硫酸軟骨素含量為33%，嘉興紐迪康生物科技有限公司，中國），DMEM高糖培養(yǎng)基［維森特生物技術(shù)（中國）有限公司］，胎牛血清［維森特生物技術(shù)（中國）有限公司］，青鏈霉素混合液（Life Technologies公司，美國），IL-1β（Cell Signaling Technology公司，美國），CellTiter 96TM Aqueous One Solution Reagent細胞增殖試劑盒（Promega，美國），0.25%胰蛋白酶［維森特生物技術(shù)（中國）有限公司］，Alexa Fluor?488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit with Alexa?（Invitrogen公司，美國），F(xiàn)xCycleTMPI/RNase Staining Solution（Life Technologies公司，美國），Quick StartTMBradford 1×Dye Reagent（Bio-Rad公司，美國），Bcl-xl Antibody（Cell Signaling Technology公司，美國），Survivin Antibody（Cell Signaling Technology公司，美國），p65 Antibody（Santa Cruz，美國），p-p65 Antibody（Cell Signaling Technology公司，美國），STAT3 Antibody（Santa Cruz公司，美國），p-STAT3 Antibody（Cell Signaling Technology公司，美國），β-actin Antibody（Santa Cruz公司，美國），ERK（Cell Signaling Technology公司，美國），p-ERK（Cell Signaling Technology公司，美國）。倒置生物顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，中國），生物安全柜NUAIR（天美科技公司，中國），CO2細胞培養(yǎng)箱（SANYO三洋公司，日本），全波長酶標儀Sepctra Max M5（Molecular Devices公司，美國），高速冷凍離心機（浙江省科學(xué)儀器進出口有限公司，中國），BD AccuriTMC6 Plus Flow Cytometer（BD Biosciences公司，美國），ImageQuant LAS 4000mini成像儀（通用電氣GE，美國）。

二、實驗方法

（一）藥物配制

取鯊魚軟骨粉（含33%的硫酸軟骨素）3.7878 g，加入50 ml去離子水?dāng)嚢柚寥芙?，將藥物溶液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，室溫下，10 000 r/min，離心10 min。吸取上清液，0.22 μm過濾器除菌過濾后即得到硫酸軟骨素濃度為25 mg/ml的鯊魚軟骨粉母液，以下統(tǒng)稱鯊魚軟骨粉溶液，不同濃度的鯊魚軟骨粉溶液均由鯊魚軟骨粉母液加培養(yǎng)基配置。在10 μg的IL-1β粉末中加入200 μl的PBS，配成濃度為50 μg/ml的IL-1β母液，使用時用培養(yǎng)基稀釋為所需濃度。

（二）軟骨細胞培養(yǎng)

將細胞放入細胞培養(yǎng)箱中靜置2 h，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)及數(shù)量。待細胞融合率達到80%～90%時即可傳代。棄原培養(yǎng)基，加入3 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）清洗2次。加入1 ml 0.25%胰酶，放入培養(yǎng)箱內(nèi)消化約1 min。加入3 ml培養(yǎng)基，輕輕吹打終止消化。再將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管。室溫下，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，吸取完全后，培養(yǎng)基吹勻細胞，按1∶2將細胞接種到新的培養(yǎng)皿中，搖勻。于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。

（三）細胞增殖檢測

在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，待細胞融合率達90%時常規(guī)消化細胞，將細胞接種于24孔板中，接種密度為每孔2×104個細胞，貼壁培養(yǎng)24 h。將細胞分為對照組和鯊魚軟骨粉組。對照組不作處理，更換新鮮培養(yǎng)基；鯊魚軟骨粉組分別加入0.1、0.2、1、5、10 mg/ml鯊魚軟骨粉溶液，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。采用MTS法，酶標儀檢測490 nm下的吸光度值（A490值）。

（四）細胞凋亡檢測

將生長狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h。將細胞分為對照組、IL-1β組和鯊魚軟骨粉組。對照組不作處理，IL-1β組和鯊魚軟骨粉組加10 ng/ml IL-1β處理24 h后，鯊魚軟骨粉組加入鯊魚軟骨粉溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)48 h。

室溫下消化收集細胞于離心管中，1 000 r/min，離心5 min，吸棄上清液。預(yù)冷的PBS清洗細胞兩次。按照凋亡試劑盒的說明書對細胞進行染色：將5×annexin-binding buffer稀釋為1×。將5 μl 1 mg/ml的PI與45 μl 1× annexin-binding buffer混勻，使PI的終濃度為 100 μg/ml。取 100 μl 1×annexin-binding buffer吹散細胞后加入5 μl Alexa Fluor?488 annexin V 和 1 μl 100 μg/ml的 PI。室溫下孵育 15 min。加入400 μl 1×annexin-binding buffer，輕吹混勻。放置在冰上，流式細胞儀檢測。結(jié)果用BD Accuri C6 Plus軟件處理。

（五）細胞周期檢測

收取各組細胞于1.5 ml離心管中，70%的乙醇吹散細胞，固定過夜。PBS清洗細胞兩次，室溫下，1 000 r/min，離心5 min，吸棄上清液。每個離心管中加入 500 μl FxCycleTM PI/RNase Staining Solution，吹勻細胞。室溫下，避光孵育15 min。盡快上流式細胞儀檢測。結(jié)果用Modifit軟件處理。

（六）Western blot

棄各孔培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗2次，每孔加入60 μl裂解液。用細胞刮刀刮下細胞并收集到1.5 ml離心管中，旋轉(zhuǎn)裂解40 min。4℃，13 000 r/min，離心30 min。小心吸取上清液到新的1.5 ml離心管中。用Quick StartTMBradford試劑進行蛋白質(zhì)的定量檢測。蛋白質(zhì)溶液與上樣緩沖液混合后，充分煮沸變性10 min，進行sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至 Polyvinylidene fluoride（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)印完畢后室溫下用5%脫脂牛奶進行封閉1 h，Phosphate buffered saline tween-20（PBST）清洗3次，每次5 min。于4℃冰箱內(nèi)孵育一抗過夜。PBST清洗3次，每次10 min。室溫下孵育二抗1 h，用enhanced chemiluminescence（ECL）顯色液顯色后，于 ImageQuant LAS 4000mini成像系統(tǒng)曝光。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以均值±標準差（）表示，采用SPSS 20.0軟件（IBM公司，美國）進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01表示有顯著性差異，P＜0.001表示具有極顯著性差異。

結(jié) 果

一、鯊魚軟骨粉溶液對軟骨細胞增殖的影響

分別用濃度為0.1、0.2、1、5、10 mg/ml的藥物溶液處理軟骨細胞48 h后，結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，在藥物濃度為0.1～5 mg/ml時，軟骨細胞隨著藥物濃度的增加而增多，濃度為0.2、1、5 mg/ml時與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001），在5 mg/ml時促進作用最為明顯，而當(dāng)藥物濃度達到10 mg/ml時，軟骨細胞的增殖反而受到抑制。因此選用5 mg/ml進行后續(xù)實驗。

二、鯊魚軟骨粉溶液對軟骨細胞凋亡的影響

IL-1β組和鯊魚軟骨粉組細胞凋亡情況如圖2所示，與對照組相比，IL-1β組的軟骨細胞凋亡明顯增加（P＜0.001），與IL-1β組相比，鯊魚軟骨粉組的軟骨細胞凋亡明顯減少（P＜0.001）。

三、鯊魚軟骨粉溶液對軟骨細胞周期的影響

如圖3所示，與對照組相比，IL-1β組細胞經(jīng)IL-1β處理后G1期細胞比例增加，S期細胞比例降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與IL-1β組比較，鯊魚軟骨粉組的細胞經(jīng)5 mg/ml的鯊魚軟骨粉溶液處理后，G1細胞明顯減少（P＜0.001），S期和G2期細胞比例明顯增加（P＜0.001，P＜0.01）。

四、鯊魚軟骨粉溶液對炎癥因子磷酸化的影響

STAT3和NF-κB蛋白家族重要成員p65是兩種關(guān)鍵的促炎信號分子，經(jīng)磷酸化激活后發(fā)揮作用。如圖4所示，與對照組相比，IL-1β組軟骨細胞內(nèi)STAT3和p65的磷酸化增加（P＜0.01，P＜0.001），其中p65磷酸化增加的尤其明顯；與IL-1β組相比，鯊魚軟骨粉組軟骨細胞內(nèi)STAT3和p65的磷酸化明顯減少（P＜0.05，P＜0.001）。各組STAT3和p65蛋白的總表達量并沒有顯著的變化（P均＞0.05）。

五、鯊魚軟骨粉溶液對ERK蛋白磷酸化的影響

如圖5所示，與對照組相比，IL-1β組軟骨細胞內(nèi)ERK的磷酸化明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。而與IL-1β組相比，鯊魚軟骨粉組軟骨細胞內(nèi)ERK的磷酸化明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組ERK蛋白的總表達量并沒有顯著的變化（P均＞0.05）。

圖1 鯊魚軟骨粉溶液對軟骨細胞增殖的影響

圖2 鯊魚軟骨粉溶液對軟骨細胞凋亡的影響

六、鯊魚軟骨粉溶液對抗凋亡蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，IL-1β組軟骨細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-xl和Survivin的表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與IL-1β組相比，鯊魚軟骨粉組軟骨細胞內(nèi)Bcl-xl和Survivin的表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。

討 論

OA是一種骨關(guān)節(jié)退行性病變，多見于中老年人及肥胖病人。常用的藥物多為非甾體類抗炎藥和鎮(zhèn)痛藥，都只能起到暫時緩解關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥和疼痛的效果，而對于減緩病情發(fā)展、減少或修復(fù)關(guān)節(jié)損壞幾乎沒有效果［7］。近年來，對于骨關(guān)節(jié)炎的研究及治療越來越多地集中在修復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)，減緩軟骨細胞死亡，從而減緩病情發(fā)展［8-10］。鯊魚軟骨粉是從鯊魚軟骨中分離提純得到的生物制品，含有豐富的生物活性成分，其中最早確定藥用價值的成分為硫酸軟骨素。本實驗中我們用不同濃度的鯊魚軟骨粉溶液處理人正常軟骨細胞C28/I2后，發(fā)現(xiàn)在一定藥物濃度范圍內(nèi)，軟骨細胞的數(shù)量隨著藥物濃度升高而增多，且在5 mg/ml時細胞達到最多，說明鯊魚軟骨粉溶液能夠促進軟骨細胞的增殖，在本實驗條件下，濃度為5 mg/ml時促進作用最強。

在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中，促炎因子IL-1β對于病情的加重起著至關(guān)重要的作用。IL-1β能夠刺激基質(zhì)金屬蛋白酶和蛋白聚糖酶的表達，而這兩者均能引起軟骨細胞的降解［11］。IL-1β能刺激軟骨細胞中環(huán)氧合酶（COX）-2和前列腺素等炎癥因子表達從而進一步加重炎癥反應(yīng)［12］。IL-1β還能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多條信號通路使得軟骨細胞發(fā)生壞死或凋亡［13］。本實驗利用IL-1β刺激人正常軟骨細胞，探究鯊魚軟骨粉溶液是否對IL-1β引起的細胞凋亡起到保護作用，實驗結(jié)果顯示IL-1β處理軟骨細胞后，細胞凋亡明顯增加，而鯊魚軟骨粉溶液處理后細胞凋亡明顯減少。此結(jié)果說明一定濃度的鯊魚軟骨粉溶液能夠減少IL-1β引起的細胞凋亡，對軟骨細胞起到一定的保護作用。

細胞周期分為4個階段：G1期是DNA合成的準備期，S期是DNA合成期，G2期是有絲分裂前的準備期，M期是有絲分裂期。在此過程中有兩個檢查點，一個是G1/S檢查點，其作用是確保細胞順利由G1期向S期推進，DNA準確合成。另一個是G2/M檢查點，其作用是保證細胞正常進入有絲分裂。G1期決定了細胞能否進入以下幾個階段，因此，可直接影響細胞能否繼續(xù)增殖［14，15］。本研究結(jié)果顯示IL-1β處理細胞后G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，說明IL-1β能夠引起細胞G1/S期阻滯從而抑制細胞分裂。鯊魚軟骨粉溶液處理細胞后，G1期細胞比例明顯減少，S期和G2期的細胞比例明顯增加，說明鯊魚軟骨粉溶液能夠緩解IL-1β對細胞周期的抑制，并且促進軟骨細胞有絲分裂的進行。

圖3 鯊魚軟骨素溶液對軟骨細胞周期的影響

NF-κB和STAT3是細胞內(nèi)兩條重要的信號通路的關(guān)鍵調(diào)控分子，其調(diào)控下游多種炎癥因子的表達，是炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展必不可少的調(diào)控通路。正常情況下，NF-κB以無活性的形式存在于細胞中，而經(jīng)IL-1β刺激后，NF-κB被磷酸化激活，進入到細胞核從而調(diào)節(jié)炎癥分子的表達［16］。有實驗證明敲除NF-κB家族成員p65能夠減少IL-1β刺激引起的軟骨細胞內(nèi)COX-2、一氧化氮合酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達［17］。STAT3的激活過程與NF-κB類似，而且同樣在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞內(nèi)對于炎癥因子的調(diào)控發(fā)揮重要的作用。實驗證明IL-1β能夠刺激STAT3磷酸化而使其激活，促進炎癥因子及凋亡因子的表達，抑制STAT3激活后能明顯減少軟骨細胞凋亡，減輕軟骨組織損壞［18，19］。因此本實驗觀察鯊魚軟骨粉溶液是否能夠減少p65及STAT3的激活，結(jié)果顯示IL-1β刺激軟骨細胞后p65及STAT3的磷酸化明顯增加，而鯊魚軟骨粉溶液處理細胞后p65及STAT3的磷酸化明顯減少，說明鯊魚軟骨粉溶液能夠通過減少p65及STAT3磷酸化抑制其激活。

圖4 鯊魚軟骨粉溶液對STAT3和p65磷酸化的影響

圖5 鯊魚軟骨粉溶液對ERK磷酸化的影響

圖6 鯊魚軟骨粉溶液對Bcl-xl和Survivin表達的影響

細胞外調(diào)節(jié)激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）是MAPK家族一類代表性的激酶，與細胞的增殖分化、細胞骨架的構(gòu)建、細胞凋亡等基本生命活動密切相關(guān)。IL-1β能夠刺激軟骨細胞內(nèi)ERK的磷酸化，而且在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞內(nèi)MAPK的磷酸化水平要高于正常的軟骨細胞［20］。MAPK家族蛋白激活后能夠促進眾多炎癥調(diào)節(jié)因子的表達，包括一氧化氮、前列腺素以及基質(zhì)金屬蛋白酶等，而這些炎癥調(diào)節(jié)分子會進一步加重炎癥、破壞軟骨結(jié)構(gòu)［21］。Bcl-xl和Survivin是兩種抗凋亡蛋白，當(dāng)Bcl-xl上調(diào)后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細胞凋亡減少，而且有實驗證明Bcl-xl的上調(diào)與抑制STAT3激活有關(guān)［22］。Survivin的表達受到抑制后可引起軟骨細胞周期阻滯從而誘導(dǎo)細胞凋亡［23］。本實驗結(jié)果顯示鯊魚軟骨粉溶液能減少IL-1β引起的ERK磷酸化，減弱IL-1β對Bcl-xl和Survivin的抑制作用。說明鯊魚軟骨粉溶液能夠減少ERK的激活，增加Bclxl和Survivin的表達從而減少IL-1β引起的軟骨細胞凋亡。

綜上，本實驗證明了鯊魚軟骨粉溶液能夠促進軟骨細胞增殖、減少IL-1β引起的軟骨細胞凋亡及細胞周期阻滯，其可能的機制包括減少炎癥因子p65、STAT3及細胞外調(diào)節(jié)激酶ERK的激活、增加抗凋亡蛋白Bcl-xl、Survivin的表達。骨關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)特殊，損壞之后很難恢復(fù)，而且骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚沒有確定的病因。在國外，硫酸軟骨素已經(jīng)被作為輔助用藥治療骨關(guān)節(jié)炎［24］。本實驗的結(jié)果為鯊魚軟骨粉溶液成為骨關(guān)節(jié)炎的輔助用藥提供了一定的理論依據(jù)，但細胞內(nèi)信號通路的調(diào)控機制錯綜復(fù)雜，鯊魚軟骨粉溶液對于軟骨細胞的作用及其機制還有待于進一步研究。