薛思源 趙 靜林成敏 莊 彥

（1.浙江省溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江溫州 325000）

青光眼是視力喪失的常見原因，為不可逆轉的致盲疾病，其發(fā)病與年齡、遺傳等多因素有關，眼壓升高與青光眼的發(fā)生發(fā)展密切升高，降低眼內壓可有效防治疾?。?-2]。眼內壓與房水的運輸密切相關，眼內壓過高或者持續(xù)時間過長，可造成視神經的損傷，甚至失明，高眼壓狀態(tài)下活性氧在視網膜蓄積，加重視網膜細胞損傷［3-4]。 低氧誘導因子-1α（HIF-1α）為缺氧環(huán)境下高度特異性核因子，可激活下游靶基因的表達，適應缺血缺氧環(huán)境，低氧環(huán)境時HIF-1α降解受到抑制，其蛋白水平急劇增加，引起系列細胞缺氧反應［5-6]。韓靜等研究發(fā)現，急性高眼壓大鼠視網膜HIF-1α表達水平降低，通過活血化瘀方干預后HIF-1α表達升高，發(fā)揮視網膜損傷保護作用［7]。中醫(yī)藥在青光眼性視神經損傷方面具有獨特優(yōu)勢。疏肝通竅方為本院治療青光眼的臨床治療的經驗方，可顯著改善患者的視力和視野，具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不明確。本研究通過建立急性高眼壓大鼠模型，研究疏肝通竅法對急性高眼壓大鼠視網膜神經損害的保護作用，并從氧化應激和HIF-1α表達水平方面探討其作用機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠60只，健康無眼疾，體質量（200±20） g，雌雄各半，鼠齡 8～10 周，北京維通利華實驗動物技術有限公司 ［SCXK-（京）2017-0061]。在（23±2）℃環(huán)境中采用12 h晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由地飲水與進食，適應環(huán)境飼養(yǎng)1周進行試驗。實驗動物及條件符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2 藥物與試劑 疏肝通竅方（組成：柴胡10 g，葛根10 g，當歸 10 g，郁金 10 g，石菖蒲 10 g，丹參 10 g，枸杞子10 g，防風10 g），由筆者所在醫(yī)院藥房提供，制成質量濃度1 g/mL的藥液備用；倍諾喜滴眼液，參天株式會社生產，批號180217。水合氯醛，上?；瘜W試劑供應站生產；多聚甲酸，北京全世金生物科技有限公司生產；中性樹膠，中國上海戴洋儀器有限公司生產；TUNEL凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒，由碧云天生物科技有限公司生產；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒，武漢華美生物工程有限公司生產；HIF-1α單抗，北京中同生物技術有限公司生產；引物合成，上海生物工程公司合成；Trizol提取試劑盒，由寶生物工程有限公司生產；二甲苯、乙醇等試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 實驗儀器 手術顯微鏡和手術器械，由蘇州視覺醫(yī)療設備公司生產；LDZ-2型低速離心機，由北京京立離心機有限公司生產；ELx800酶標儀，由美國伯騰儀器有限公司生產；Tono-pen-avia筆式眼壓計，由美國Mentor公司生產；BX60顯微鏡，由日本Olympus Optical公司生產；數碼醫(yī)學圖像分析系統，由麥克奧迪實業(yè)集團有限公司生產；全自動免疫染片機，美國DAKO公司生產；RT-PCR擴增分析系統，由美國羅氏公司生產。

1.4 分組與造模 60只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組，每組20只。對照組正常飼養(yǎng)。將模型組和干預組采用前房灌注加壓法制備急性高眼壓大鼠模型，造模前測量眼壓排除眼壓異常大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定，氯霉素滴眼液沖左眼，倍諾喜滴眼液滴左眼表面麻醉，穿刺針頭于左眼平行于瞳孔緣迅速推進，孔眼朝下并位于瞳孔區(qū)中央并固定，生理鹽水瓶懸置于角膜頂點90 cm，打開輸液器，保持輸液器內液體不滴，90 min后瞳孔散大，眼前節(jié)輕度缺血，眼壓大于21 mmHg且高眼壓連續(xù)持續(xù)7 d以上為造模成功［8]，點氯霉素眼液預防感染。對照組僅做穿刺處理，不加壓。

1.5 給藥方法 造模后模型組、干預組給予4 mL疏肝通竅方藥液灌胃，對照組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，每天1次，分別于第3日和第7日處死各組10只大鼠觀察。

1.6 標本采集與檢測 1）眼壓測定：鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，Tono-pen-avia筆式眼壓計連續(xù)測量眼壓3次，取平均值。2）視網膜形態(tài)學：分別于第3日和第7日處死各組10只大鼠，取左眼，生理鹽水清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察視網膜各層結構。3）視網膜細胞凋亡：將視網膜切成0.5 mm3小塊，多聚甲醛磷酸固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加TUNEL試劑盒反應液和復合液，DAB顯色，蘇木素復染并封片。顯微鏡下取5個視野觀察，正常神經節(jié)細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色，計算出細胞凋亡指數，凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。 4）MDA、SOD 和GSH-Px測定：處死各組大鼠前，心臟取血，3 000 r/min離心20 min，取上清，采用ELISA測定血清MDA、SOD和GSH-Px水平，按照說明書操作。5）HIF-1α mRNA水平測定：分離完整視網膜，吸干表面水分，Trizol法提取視網膜總RNA，260 nm和280 nm波長檢測提取的RNA 純度，以 GAPDH（上游 5′-TTCTAGAGACAGCCG CATCT-3′，下游 5′-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3′）為內參，采用實時熒光定量PCR檢測HIF-1α mRNA水平 （上游 5′-CCATTACCTGCCTCTGA AACTCC-3′，下游 5′-CAGAAGGACTTGCTGGCTGATC-3′），40 個循環(huán)，預變性 95℃ 30 s，變性95℃ 10 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，測定每組HIF-1α mRNA 的 Ct值，計算相對表達量。 6）HIF-1α蛋白測定：視網膜石蠟切片脫蠟至水化，檸檬酸抗原修復，超純水沖洗，50 μL 3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，PBS緩沖溶液洗滌，50 μL山羊血清封閉15 min，傾去剩余溶液，滴加HIF-1α多克隆一抗稀釋液，4℃孵育過夜，PBS緩沖溶液洗滌，滴加二抗，室溫孵育2 h，PBS緩沖溶液沖洗3次，DAB顯色3 min，自來水充分沖洗，蘇木精復染，封片，HIF-1α蛋白表達量積分光密度（IOD）表示。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較組內和組間差異。計數資料以n（%）表示，應用χ2檢驗。不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠造模前后眼壓比較 見表1。造模前各組大鼠眼壓水平比較，差別不大（P＞0.05）。造模后模型組眼壓高于對照組同期，干預組眼壓則低于模型組同期（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠眼壓水平比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠眼壓水平比較（mmHg，±s）

與對照組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，△P＜0.05。下同

組 別 第3日 第7日對照組 20.26±1.24 20.39±1.32 n 造模前20 18.61±1.23模型組 30.17±1.62* 29.53±1.46*20 18.25±0.96干預組 20 18.44±1.02 26.41±1.89*△ 23.72±1.52*△

2.2 各組大鼠視網膜形態(tài)學觀察 見圖1。對照組視網膜組織染色均勻，結構完整清晰，神經節(jié)細胞排列規(guī)則。模型組視網膜組織水腫，隨時間延長水腫加重，各層結構紊亂，神經節(jié)細胞排列疏松，數量減少，明顯萎縮變薄。干預組視網膜腫脹減輕，神經節(jié)細胞數量較模型組增加，視網膜萎縮程度減輕。

圖1 各組大鼠視網膜病理組織切片（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠視網膜細胞凋亡指數比較 見表2。造模前各組大鼠細胞凋亡指數比較，差別不大（P＞0.05）。造模后，模型組視網膜細胞凋亡指數高于對照組同期，干預組視網膜細胞凋亡指數低于模型組同期，但高于對照組同期（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠造模后第3日、第7日MDA、SOD和GSH-Px水平比較 見表3。模型組第3日、第7日血清MDA高于對照組，SOD和GSH-Px低于對照組。而干預組第3日、第7日血清MDA水平與模型組比較則降低，SOD和 GSH-Px則升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠視網膜細胞凋亡指數比較（%，±s）

表2 各組大鼠視網膜細胞凋亡指數比較（%，±s）

組 別 第3日 第7日對照組 4.26±1.32 4.52±1.41 n 造模前20 3.61±1.17模型組 53.17±6.27* 50.61±7.12*20 4.25±1.07干預組 20 4.19±1.14 32.08±7.13*△ 27.61±5.37*△

表3 各組大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px水平比較（±s）

組 別 時 間 GSH-Px（ng/mL）對照組 第3日 183.14±21.37（n＝20） 第 7 日 185.27±22.38模型組 第3日 90.36±23.05*MDA（ng/mL） SOD（IU/mL）3.18±0.75 89.23±4.38 3.28±0.96 90.12±4.51 8.26±1.03* 67.12±5.23*（n＝20） 第 7 日 89.01±24.26*8.07±1.12* 65.37±5.42*干預組 第 3 日 6.67±1.32*△ 75.33±5.76*△ 129.64±25.06*△（n＝20） 第 7 日 4.29±1.37*△ 80.67±5.71*△ 136.75±24.12*△

2.5 各組大鼠造模后第3日、第7日HIF-1α mRNA水平比較 見表4。模型組第3日、第7日HIF-1α mRNA水平高于對照組，而干預組第3日、第7日HIF-1α mRNA水平則低于模型組同期，但高于對照組同期（均P＜0.05）。

表4 各組大鼠HIF-1α mRNA水平比較（±s）

表4 各組大鼠HIF-1α mRNA水平比較（±s）

組 別 第3日 第7日對照組 1.00±0.03 1.00±0.02 n 20模型組 2.97±0.12* 3.02±0.14*20干預組 20 1.61±0.09*△ 1.28±0.08*△

2.6 各組大鼠造模后第3日、第7日HIF-1α蛋白水平 見圖2和表5。模型組第3日、第7日視網膜可見HIF-1α棕黃色顆粒表達，模型組第3日、第7日HIF-1α蛋白IOD值高于對照組，干預組第3日、第7日HIF-1α弱于模型組，第3日、第7日HIF-1α蛋白IOD值低于模型組（均P＜0.05）。

圖2 各組視網膜HIF-1α蛋白免疫組化圖（DAB染色，400倍）

表5 各組大鼠視網膜HIF-1α蛋白水平比較（IOD，±s）

表5 各組大鼠視網膜HIF-1α蛋白水平比較（IOD，±s）

組 別 第3日 第7日對照組 0.25±0.04 0.27±0.03 n 20模型組 1.73±0.14* 1.69±0.11*20干預組 20 1.01±0.10*△ 0.81±0.07*△

3 討 論

青光眼視神經萎縮的發(fā)病機制與機械壓迫和血管缺血有關。眼壓作用于篩板直接壓迫視神經纖維，導致細胞代謝受損，缺血缺氧及視神經纖維失去周圍組織的保護，眼壓升高進一步加重視網膜神經調節(jié)障礙［9]。視神經損害主要表現為中心視野的損害，隨后出現管狀視野，最終導致失明，是由視網膜神經節(jié)細胞損傷變性和凋亡引起，高眼壓導致缺血缺氧，使視神經纖維軸漿流中斷［10]。高眼壓狀態(tài)下，視網膜細胞內自由基，MDA的體內表達水平是脂質過氧化作用的指標，GSH-Px是酶促抗氧化劑，與細胞內外各種酶結合，對機體各組織器官造成損傷，自由基則會影響細胞的正常結構和功能，導致視網膜細胞損傷受，SOD可通過催化超氧化物陰離子，發(fā)揮清除自由基的作用［11-12]。HIF-1α為氧依賴轉錄激活因子，缺氧條件下活性增強，表達增多，激活血管形成、細胞凋亡等靶基因，在缺血缺氧過程中發(fā)揮重要作用［13]。研究表明，眼壓升高后視網膜HIF-1α表達增加，視網膜損害與HIF-1α表達增多有關，輕度缺氧使HIF-1α表達增加，改善能量代謝和血管生成，為青光眼的發(fā)病機制及治療靶點研究熱點［14]。

中醫(yī)藥對青光眼視神經保護具有特有的優(yōu)勢，《靈樞·大惑論》曰 “五臟六腑之精氣皆上注于目而為之精”，而“肝開竅于目”，眼與人體五臟六腑，尤其與肝的關系最為密切。中醫(yī)認為青光眼肝氣郁結，氣郁無助血前行，眼部氣血癖滯，脈道阻塞，治宜疏肝解郁、通奇明目。疏肝通竅方為本院治療青光眼的臨床治療的經驗方，方中柴胡疏肝解郁明目，對肝郁腎虛型外傷性視神經萎縮治療作用顯著，能有效提高患者視力；葛根和石菖蒲加強君藥疏肝理氣、通竅明目，葛根有緩解腦血管痙攣，舒張小動脈，改善眼底微循環(huán)，增加血液供應作用；石菖蒲《本草正義》指出其“使耳目聰明，九竅通利”，揮發(fā)油有血管擴張作用；當歸、郁金、丹參為佐藥，活血化癖，通絡明目，當歸活血通經、祛疲止痛，《審視瑤函》當歸活血飲，用于治療眼病胞輪振跳，抑制氧化反應和自由基反應等，促進腦血紅蛋白表達的恢復，具有保護視網膜的作用；郁金還可助君藥疏肝理氣，可引藥入血，增強疏肝止痛作用，有降血脂，抗真菌作用；丹參祛癖止痛、清心除煩、通血脈，對局部血液疲滯作用明顯，調節(jié)微循環(huán)血流速度，增強細胞的抗缺血、缺氧能力。枸杞子明目益精、益肝補腎，抗衰老、抗氧化損傷和抗細胞凋亡的作用；防風祛風解痙、梳理肝脾、調暢氣機，與活血化瘀藥物配伍有增效作用［15-18]。疏肝通竅方諸藥配伍，共奏疏肝解郁、通竅明目功效，可有效保護高眼壓視網膜組織。

本研究發(fā)現，干預組眼壓低于模型組，視網膜腫脹減輕，神經節(jié)細胞數量較模型組增加，視網膜萎縮程度減輕，視網膜細胞凋亡指數低于模型組，血清MDA水平降低，SOD和GSH-Px升高，干預組HIF-1α mRNA水平和蛋白IOD值低于模型組。這與疏肝通竅方中柴胡增強免疫功能，影響神經營養(yǎng)因子的表達，減少興奮性氨基酸；葛根擴張冠狀動脈，抗氧自由基及抗脂質過氧化，提高局部微血流量；石菖蒲減輕由興奮性氨基酸引起的神經毒性作用，當歸抑制神經炎癥反應，增強抗氧化能力；郁金改善血液循環(huán)，清除自由基；丹參改善微循環(huán)，調節(jié)血管內皮細胞；枸杞子抗氧化損傷，提高SOD活性；防風改善視網膜血供，擴血管改善微循環(huán)等密切相關［19-20]。

綜上所述，疏肝通竅方可保護急性高眼壓大鼠視網膜組織，減輕損害程度，其機制可能與抑制機體氧化應激和降低視網膜HIF-1α表達有關。