張珊珊 姚小龍 王珂 尤雅

（北京工商大學(xué)，北京 100048）

甲酸乙酯是一種常用的化工原料，常用作溶解醋酸或硝酸纖維的溶劑、香料添加劑、以及殺菌劑和殺幼蟲(chóng)劑［1-3］。甲酸乙酯廣泛存在化工行業(yè)的廢水中，直接排放含有甲酸乙酯的廢水會(huì)對(duì)生物和環(huán)境造成很大的危害。當(dāng)甲酸乙酯的濃度高于1 000 mg/m3時(shí)，會(huì)略微刺激人體的眼睛、鼻子和肺部。在急性吸入研究中，Opdyke等［4］發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸乙酯濃度為24 000 mg/m3時(shí)，會(huì)對(duì)6只大鼠中的5只引起致死。毒性跡象包括對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制以及對(duì)呼吸循環(huán)的影響［5-6］。荷蘭衛(wèi)生委員會(huì)關(guān)于甲酸乙酯的職業(yè)接觸限值和每日允許食品和化妝品毒理學(xué)設(shè)定的甲酸乙酯攝入限值，建議人類每天不應(yīng)暴露于1 000 mg/m3以上的甲酸乙酯環(huán)境中［7］。另一方面，排入環(huán)境的甲酸乙酯揮發(fā)進(jìn)入大氣后，在一定環(huán)境條件下能夠發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，形成光化學(xué)煙霧［8-10］。因此，治理廢水中的甲酸乙酯對(duì)人類健康和環(huán)境保護(hù)都具有重要的意義。

常用的甲酸乙酯凈化方法包括吸附法［11］、Fenton氧化法等［12］，而利用生物法對(duì)甲酸乙酯的降解性能研究較少。由于生物法具備凈化效率高、成本低、對(duì)環(huán)境無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)［13］。利用生物法處理廢水中的甲酸乙酯，對(duì)于認(rèn)識(shí)甲酸乙酯在微生物中的降解機(jī)理，開(kāi)發(fā)具備低成本、高降解性能的甲酸乙酯降解技術(shù)具有重要意義。

本研究中，使用甲酸乙酯為唯一碳源，通過(guò)篩選和馴化，從活性污泥中分離出一株能高效降解高濃度甲酸乙酯的細(xì)菌。研究了pH和溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，并研究了降解菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，以及不同濃度的甲酸乙酯對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)及降解的影響。通過(guò)代謝產(chǎn)物的分析，探討細(xì)菌對(duì)甲酸乙酯的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品（活性污泥）來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)活性污泥來(lái)源于北京某污水處理廠二沉池?；钚晕勰鄻悠啡雍螅糜?20℃冰箱中待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑為ZnSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7 H2O，MnSO4·7 H2O，Co（NO3）2·6 H2O，CuSO4·5 H2O，KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4·7 H2O，NaCl，LB肉湯，蛋白胨，甲酸乙酯（北京頤豐天成科技有限公司）。主要儀器為分析天平（北京賽多利科學(xué)儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B Agilent）、可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UNICO 2000）、高壓蒸汽滅菌器（Panasonic公司）、超凈操作臺(tái)（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）、低溫冷凍離心機(jī)（Sigma公司）、PCR 儀（TECHNE 公司）、智能冰箱（SAMSUNG公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基）：牛肉膏10.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化鈉 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.0±0.2，于120℃ 滅菌15 min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.45 g/L，Na2HPO40.47 g/L，痕量金屬溶液 1 mL/L，pH 7.00±0.2，121℃高壓滅菌 40 min。其中，痕量金屬溶液有FeSO4·7 H2O 0.55 g/L，ZnSO4·7 H2O 0.23 g/L，MnSO4·7 H2O 0.34 g/L，Co（NO3）2·6 H2O 0.075 g/L，CuSO4·5 H2O 0.047 g/L，（NH4）6MO7O24·4H2O 0.025 g/L［14］。

篩選培養(yǎng)基：在滅過(guò)菌的基本培養(yǎng)基中加入甲酸乙酯。

1.2 方法

1.2.1 甲酸乙酯降解菌的分離與純化 將活性污泥用高純水稀釋10倍，并過(guò)篩形成細(xì)菌懸浮液作為接種物。取5 mL稀釋并過(guò)篩后的活性污泥接種到45mL已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入500 mg/L的甲酸乙酯。置于170 r/min，30℃的搖床中培養(yǎng)48 h。之后，將5 mL的混合物接種到新的45 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入800 mg/L的甲酸乙酯，放于170 r/min，30℃的搖床中培養(yǎng)48 h。再取5 mL的混合物放入新的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入1 000 mg/L的甲酸乙酯，放于170 r/min、30℃的搖床中培養(yǎng)48 h。富集結(jié)束后，使用稀釋涂布法和平板劃線法篩選出能以甲酸乙酯為碳源的單菌落，并分離純化。

1.2.2 復(fù)篩降解菌株 為了選擇具有最高甲酸乙酯降解效率的菌株，進(jìn)一步篩選獲得的菌株。將1.2.1節(jié)中分離出的純菌落與含有1 000 mg/L的甲酸乙酯和20 000 mg/L瓊脂的混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將純化好的菌株與5 mL無(wú)菌水混合并形成細(xì)菌懸浮液。取樣1 mL細(xì)菌懸浮液并以10 000 r/min的速度離心5 min。收集離心后的沉淀并用蒸餾水洗滌2次后并重新接種到5 mL富集培養(yǎng)基中，其中加入1%的甲酸乙酯。于30℃，170 r/min的搖床里培養(yǎng)24 h。取樣1 mL細(xì)菌懸浮液并以14 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾液體。之后通過(guò)氣相色譜儀（7890B Agilent）測(cè)量甲酸乙酯的降解率。氣相色譜儀的測(cè)試方法為：色譜柱為DB-624毛細(xì)血管柱，進(jìn)樣口溫度為220℃，氫火焰離子化檢測(cè)器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度為250℃，空氣流量為400 mL/min，尾吹氣流量為25 mL/min。柱溫：恒溫70℃，保持8 min［15］。選擇最佳降解率的菌株用于進(jìn)一步研究。

1.2.3 菌株的生理生化測(cè)定 生理生化實(shí)驗(yàn)：根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［16］進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、MR試驗(yàn)等測(cè)定。

1.2.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增 鑒定菌株在30℃LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，1.5 mL菌液在轉(zhuǎn)速為12 000 r/min下離心收集菌體，并對(duì)該菌株16S rDNA基因序列分析。利用DNA提取試劑盒提取總DNA作為PCR模板，選用16S 菌保守序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。16S rDNA擴(kuò)增的引物為 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和 1 492R GGTTACCTTGTTACGACTT［17］。PCR 所 用 酶 為ExTaq，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，12℃保存。得到750 bp的片段，測(cè)序得到菌株ETH-3的16S rDNA全序列，并將序列上傳到NCBI基因庫(kù)中。利用BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。最后在MEGA 6.0軟件中繪制發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 菌株生長(zhǎng)曲線及其動(dòng)力學(xué)的研究 取22支盛有5 mL LB肉湯的試管，滅菌后備用。其中11支接種0.25 mL已培養(yǎng)12 h的甲酸乙酯降解菌過(guò)夜培養(yǎng)液（使初始OD600達(dá)到0.01）。另11支作為對(duì)照。將22支試管置于恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，溫度設(shè)置為30℃，轉(zhuǎn)速170 r/min。每隔2 h取樣檢測(cè)其在600nm處的吸光度值。檢測(cè)篩選出的微生物生長(zhǎng)曲線。

根據(jù)菌株在不同時(shí)間的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，選擇修正Gompertz模型［18］擬合降解菌的生長(zhǎng)曲線。通過(guò)修正Gompertz模型［公式（1）］擬合得到的模型參數(shù)，計(jì)算出最大比生長(zhǎng)速率U［公式（2）］和微生物生長(zhǎng)的延滯期LPD［公式（3）］。最終采用R2對(duì)建立模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

由此可以得到U和LPD的計(jì)算公式：

式中，t為時(shí)間，Nt和N0分別表示在時(shí)間t時(shí)和初始時(shí)間時(shí)的微生物數(shù)量；a為最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值；tc為達(dá)到最大生長(zhǎng)速率的時(shí)間，K為在時(shí)間點(diǎn)tc的最大生長(zhǎng)速率［19］。

1.2.6 菌株的最佳生長(zhǎng)環(huán)境條件（溫度和pH） 選取不同培養(yǎng)溫度20、25、30、35和40℃，此時(shí)培養(yǎng)基的初始pH為6.60。將6份滅過(guò)菌并冷卻的LB肉湯培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，使初始OD600達(dá)到0.01。分別放入20、25、30、35和40℃的恒溫?fù)u床里，每隔4 h取樣，共取6次，每組做4個(gè)平行樣，并且用沒(méi)有接種菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基做對(duì)照。通過(guò)可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UNICO 2000）測(cè)量微生物的吸光度。

選取5個(gè)pH梯度，通過(guò)1 mol/L的HCl和20%的NaCO3將初始pH分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，測(cè)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。在已滅菌冷卻的LB肉湯培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液（使加入菌液后的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基初始OD600為0.01），以不加菌液的體系作空白對(duì)照，置30℃、170 r/min的搖床中培養(yǎng)。每隔4 h取樣，每組做4個(gè)平行樣。通過(guò)可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UNICO 2000）測(cè)量微生物的吸光度，用OD600作為細(xì)菌密度的指標(biāo)。

1.2.7 菌株對(duì)不同濃度的甲酸乙酯降解研究 研究菌株在6個(gè)不同甲酸乙酯濃度下的降解，6個(gè)甲酸乙酯濃度梯度分別是4 000 mg/L、7 500 mg/L、10 500 mg/L、15 500 mg/L、20 500 mg/L和 60 000 mg/L。每個(gè)濃度梯度做4個(gè)平行樣。以不接菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照。對(duì)照組培養(yǎng)基跟實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入相同的培養(yǎng)6 h的微生物量，但是對(duì)照組中不添加甲酸乙酯。培養(yǎng)基中加入的微生物量為1%（體積分?jǐn)?shù)）。對(duì)照組培養(yǎng)基和不同濃度甲酸乙酯的培養(yǎng)基同時(shí)置于30℃，170 r/min的搖床中培養(yǎng)。24 h前每隔4 h取樣，36 h時(shí)再取一次樣。檢測(cè)微生物的生長(zhǎng)情況、pH變化及降解率的變化。所有取樣在無(wú)菌操作臺(tái)里操作。

底物中甲酸乙酯的測(cè)定方法同1.2.2節(jié)測(cè)定的方法。

1.2.8 中間代謝產(chǎn)物分析 選用降解后的樣品，14 000 r/min離心5 min。用0.22 μm的濾膜過(guò)濾液體。取上清液置于60℃的水浴鍋中，采用SPE（Solid phase extraction）固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS分析代謝產(chǎn)物成分［20］。GC-MS的分析條件為：采用程序升溫40℃（維持10 min），再以50℃·min-1的速率升到180℃（維持5 min）；進(jìn)樣口溫度150℃；載氣為高純氮?dú)猓环至鞅葹?∶1。進(jìn)樣量為1 μL。

2 結(jié)果

2.1 菌種的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)特征觀察 初步篩選分離后，從活性污泥中獲得3株降解菌。進(jìn)一步研究3株菌株對(duì)甲酸乙酯的降解率以篩選出具有最高降解效率的最佳菌株。在初始有機(jī)物濃度為8 000 mg/L時(shí)，36h內(nèi)，在30℃下，發(fā)現(xiàn)ETH-3菌株對(duì)甲酸乙酯的去除率最高，高達(dá)100%。因此，選擇ETH-3進(jìn)行進(jìn)一步研究。菌株ETH-3肉眼可以看到清晰的單菌落，菌落較小且扁平，呈現(xiàn)不規(guī)則圓形，直徑0.5-3 mm左右，濕潤(rùn)。其在平板上的形態(tài)如圖1所示。

圖1 菌株在平板上的形態(tài)

2.1.2 菌株的生理生化結(jié)果及分子生物學(xué)鑒定 菌株ETH-3的5個(gè)生理生化試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，為革蘭氏陰性菌，吲哚試驗(yàn)陰性，葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，且產(chǎn)酸也產(chǎn)氣，V-P試驗(yàn)陰性，MR試驗(yàn)陽(yáng)性。對(duì)菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及16S rDNA基因鑒定后，根據(jù)BLAST結(jié)果，表明該菌株與Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida親源關(guān)系最近，同源性達(dá)99%以上。在NCBI上下載與菌株ETH-3所測(cè)序列較高相似性的序列，在MEGA 6.0軟件中繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖（圖3）。結(jié)合菌株的形態(tài)觀察結(jié)果及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，確定該菌株鑒定為殺蛙氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）。

表1 菌株ETH-3的生理生化特性

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖

圖3 菌株ETH-3的生長(zhǎng)曲線

2.1.3 菌株的生長(zhǎng)曲線及其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究 菌株ETH-3的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。運(yùn)用Origin軟件，選用SGompertz模型擬合菌株遲緩期、對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期的生長(zhǎng)曲線，如圖4所示。得到該模型的擬合參數(shù)并計(jì)算出最大比生長(zhǎng)速率U和微生物的延滯期LPD（表2）。模型的R2為0.999，說(shuō)明SGompertz模型可以很好地描述菌株的生長(zhǎng)。由表2可知，菌株在第5.9 h達(dá)到最大生長(zhǎng)率速度，菌株的OD600值最高達(dá)1.723±0.015，每小時(shí)OD600值增長(zhǎng)0.69，菌株的最大比增長(zhǎng)速率約為0.4，延遲期大約有4.497 h。

圖4 SGompertz模型擬合菌株的生長(zhǎng)期

表2 SGompertz模型得到的ETH-3的生長(zhǎng)參數(shù)

2.2 初始pH和溫度對(duì)菌株ETH-3生長(zhǎng)的影響

初始pH對(duì)菌株ETH-3生長(zhǎng)的影響如圖5所示。如圖所示，盡管菌株在pH為5-9時(shí)都可以生長(zhǎng)，但是當(dāng)初始pH為5和9時(shí)，生長(zhǎng)明顯受到抑制。當(dāng)pH等于8左右時(shí)，最有利于菌株的生長(zhǎng)。

圖5 初始pH對(duì)菌株ETH-3生長(zhǎng)的影響

初始溫度對(duì)菌株ETH-3生長(zhǎng)的影響如圖6所示。如圖所示，在22 h前，微生物的量都會(huì)隨著時(shí)間的變化而逐漸增多，當(dāng)達(dá)到22 h后，開(kāi)始出現(xiàn)衰亡期。由圖可知，雖然溫度為20-40℃時(shí)，菌株都能生長(zhǎng)，但當(dāng)溫度為25-30℃時(shí)，對(duì)菌株ETH-3生長(zhǎng)最有利。

圖6 溫度對(duì)菌株ETH-3生長(zhǎng)的影響

2.3 菌株ETH-3對(duì)不同濃度的甲酸乙酯的降解

菌株ETH-3對(duì)不同濃度的甲酸乙酯降解率如圖7所示，菌株對(duì)濃度為4 000、7 500和10 000 mg/L的甲酸乙酯，在24 h內(nèi)的降解率已經(jīng)能達(dá)到100%。當(dāng)甲酸乙酯的濃度高于10 000 mg/L時(shí)，降解率隨著甲酸乙酯濃度的升高開(kāi)始逐漸下降，菌株對(duì)15 500 mg/L的甲酸乙酯，36 h內(nèi)最高降解率達(dá)到67%。而對(duì)20 500 mg/L濃度的甲酸乙酯，36 h內(nèi)降解率最高只有53%。直至甲酸乙酯濃度為60 000 mg/L時(shí)，此時(shí)微生物對(duì)甲酸乙酯已沒(méi)有降解率。

圖7 菌株對(duì)不同濃度甲酸乙酯的降解率

圖8為微生物在不同濃度甲酸乙酯中的生長(zhǎng)情況。由圖8可以看出，當(dāng)甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L時(shí)，微生物在12 h時(shí)開(kāi)始衰亡，24 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。當(dāng)甲酸乙酯濃度為7 500 mg/L、10 000 mg/L、15 500 mg/L、20 500 mg/L時(shí)，微生物在24 h時(shí)達(dá)到微生物量的最大值，隨后緩慢減少或不變。隨著甲酸乙酯濃度的增大，微生物生長(zhǎng)量開(kāi)始減小，當(dāng)甲酸乙酯濃度大于達(dá)到10 500 mg/L時(shí)，微生物的活性受到抑制。當(dāng)濃度達(dá)到60 000 mg/L時(shí)，微生物徹底不再生長(zhǎng)。

圖8 菌株ETH-3在不同濃度甲酸乙酯中的生長(zhǎng)情況

圖9為pH隨著時(shí)間的變化曲線。從圖可知，當(dāng)甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L、7 500 mg/L、10 500 mg/L、15 500 mg/L，20 500 mg/L時(shí)，即微生物能夠降解甲酸乙酯的幾組濃度實(shí)驗(yàn)中，pH隨著時(shí)間先降低再升高。16 h之前，pH隨時(shí)間降低，都是從7降低至6左右。16 h后，pH隨時(shí)間升高，最高升高至8。而微生物活性受到徹底抑制的一組濃度實(shí)驗(yàn)，即當(dāng)甲酸乙酯濃度為60 000 mg/L時(shí)，pH隨著時(shí)間是呈現(xiàn)一直降低的趨勢(shì)。從整個(gè)圖來(lái)看，培養(yǎng)基中甲酸乙酯濃度越大，pH越低。

表3為6組不同濃度的甲酸乙酯在不同時(shí)間的降解速率。通過(guò)表3可知，微生物對(duì)6種濃度的甲酸乙酯降解最快的區(qū)間都為4 h-8 h。與圖8菌株在4 h-8 h達(dá)到最大生長(zhǎng)率速度的結(jié)果相呼應(yīng)。

2.4 中間代謝產(chǎn)物分析

通過(guò)GC-MS對(duì)甲酸乙酯降解中間產(chǎn)物的分析，得到甲酸乙酯被微生物降解的主要產(chǎn)物為乙醇。以10 500 mg/L甲酸乙酯在4 h時(shí)代謝產(chǎn)物的分析圖為例（圖10）。圖11為甲酸乙酯在4 h時(shí)降解的質(zhì)譜圖。

圖9 菌株ETH-3降解不同濃度甲酸乙酯時(shí)pH隨時(shí)間的變化

表3 六組不同濃度的甲酸乙酯在不同時(shí)間的降解速率

3 討論

生物法處理有機(jī)物目前仍有很多方面等待解決，如微生物的馴化及高效降解菌的培養(yǎng)、工藝過(guò)程的完善、微生物降解機(jī)理的研究、占地面積較大等［21］。微生物的馴化及高效降解菌的培養(yǎng)是解決占地面積較大、縮短反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)間、提高降解效率的關(guān)鍵因素。本研究從活性污泥中篩選得到一株高效降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化和16S rDNA鑒定，確定篩選出的菌株ETH-3為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）。36 h內(nèi)該菌株對(duì)初始濃度0-10 000 mg/L的甲酸乙酯能實(shí)現(xiàn)完全降解。

微生物的生長(zhǎng)曲線在廢水治理中具有很重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。通過(guò)對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線的形態(tài)分析，可以為實(shí)際處理工藝的改進(jìn)提供參考［22］。本研究通過(guò)對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究，確定菌株的最佳活性時(shí)期為5.9 h，這為實(shí)際應(yīng)用中生物塔接種的菌液培養(yǎng)時(shí)間提供了理論依據(jù)。

圖10 10 500 mg/L甲酸乙酯在4 h時(shí)的代謝產(chǎn)物分析

圖11 甲酸乙酯降解4 h時(shí)的質(zhì)譜圖

微生物的活性是決定有機(jī)物處理效率的關(guān)鍵因素。影響微生物活性的因素很多，主要有有機(jī)物底物濃度、溫度、pH值和溶解氧等。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要包括微生物生長(zhǎng)所需要的能量、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽成分等［23］。其中溫度和pH是影響菌株生長(zhǎng)的最主要因素。pH在細(xì)菌代謝中起重要作用。pH值的增加可以改變生物大分子的電荷，如蛋白質(zhì)和核酸，從而影響它們的生物活性。此外，它還能改變細(xì)胞膜的電荷，從而阻礙細(xì)胞膜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［24-26］。本研究中，菌株ETH-3生長(zhǎng)的最佳pH為8。溫度可以通過(guò)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞膜的流動(dòng)性及完整性）來(lái)影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝。過(guò)高的環(huán)境溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，而過(guò)低的溫度會(huì)使酶活力受到抑制，細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)減弱［27-28］。本研究中ETH-3生長(zhǎng)的最佳溫度為25℃。這與田會(huì)芹等［29］發(fā)現(xiàn)對(duì)于殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)最佳pH為7.5，最佳生長(zhǎng)溫度為28℃結(jié)果相符合。

目前尚無(wú)殺鮭氣單胞菌對(duì)廢水中甲酸乙酯的降解研究，已有的殺鮭氣單胞菌運(yùn)用到污水治理的為利用殺鮭氣單胞菌治理藍(lán)藻分泌的微囊藻毒素［30］。研究甲酸乙酯的濃度對(duì)微生物降解有機(jī)物及其自身生長(zhǎng)的影響，有利于為后續(xù)菌株的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。當(dāng)甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L時(shí)，微生物在12 h時(shí)就開(kāi)始衰亡，24 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定?？赡苁且?yàn)榇藭r(shí)微生物的死亡速率大于微生物的生長(zhǎng)速率，培養(yǎng)基中的微生物繼續(xù)對(duì)剩余的甲酸乙酯進(jìn)行降解，直至甲酸乙酯24 h時(shí)降解完全，此時(shí)培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量不再有明顯的變化。當(dāng)甲酸乙酯濃度為4 000 mg/L、7 500 mg/L和10 000 mg/L時(shí)，微生物在24 h時(shí)停止生長(zhǎng)，因?yàn)榇藭r(shí)培養(yǎng)基中的甲酸乙酯被完全降解，碳源被完全消耗。培養(yǎng)基中已無(wú)法提供足夠的營(yíng)養(yǎng)給菌株生長(zhǎng)。當(dāng)甲酸乙酯濃度高達(dá)20 500 mg/L時(shí)，此時(shí)有機(jī)物的濃度已經(jīng)會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)濃度達(dá)到60 000 mg/L時(shí)，微生物的活性被徹底抑制，是因?yàn)榇藭r(shí)高濃度的甲酸乙酯對(duì)微生物產(chǎn)生了毒性抑制作用［31］。甲酸乙酯在4-8 h降解速率最快的主要原因是此時(shí)微生物處于對(duì)數(shù)期，菌株在4-8 h的生理活性最高，細(xì)胞分裂繁殖最為旺盛［32］。隨著菌株慢慢達(dá)到穩(wěn)定期和衰亡期，菌株對(duì)甲酸乙酯的降解速率也隨著減慢。

本研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)每組不同濃度的降解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pH時(shí)，不加菌的對(duì)照組和微生物活性受到抑制的濃度實(shí)驗(yàn)，pH是隨著時(shí)間一直降低的，主要是因?yàn)榧姿嵋阴?huì)水解成甲酸等酸溶液，造成pH的降低［33］。甲酸乙酯濃度越高，其自身水解和被微生物降解的甲酸量越多，從而解釋了甲酸乙酯濃度越大，pH越低。而加了菌的，且甲酸乙酯濃度未達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)的幾個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)中，推測(cè)有堿性產(chǎn)物的產(chǎn)生，才導(dǎo)致pH升高。并且菌株ETH-3在pH為8時(shí)，生長(zhǎng)的最好。堿性產(chǎn)物的產(chǎn)生，且此時(shí)pH未超過(guò)8，能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。

由甲酸乙酯代謝產(chǎn)物的分析，結(jié)合甲酸乙酯降解過(guò)程中pH的變化圖，推測(cè)甲酸乙酯先被微生物降解為甲酸和乙醇，在12 h時(shí)，甲酸被微生物進(jìn)一步降解為CO2和H2O，導(dǎo)致酸性下降，pH上升。乙醇被微生物降解的主要途徑是由乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）和CYP2E1水解成乙醛和甲酮，乙醛繼而由乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）水解成乙酸，乙酸再變?yōu)橐阴］o酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終代謝為CO2和H2O［34-36］。

4 結(jié)論

本研究從活性污泥中篩選得到一株高效降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA鑒定，確定篩選出的菌株ETH-3為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）。選出的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida）的最佳生長(zhǎng)溫度為25℃，最佳生長(zhǎng)pH為8。通過(guò)對(duì)6個(gè)不同濃度的甲酸乙酯的降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在30℃下，轉(zhuǎn)速為170 r/min時(shí)，36 h內(nèi)菌株對(duì)初始濃度0-10 000 mg/L的甲酸乙酯能完全降解。通過(guò)對(duì)甲酸乙酯代謝產(chǎn)物的分析，及菌株代謝甲酸乙酯過(guò)程中pH的變化推測(cè)菌株代謝甲酸乙酯的途徑為：甲酸乙酯先被微生物降解成甲酸和乙醇，甲酸被微生物進(jìn)一步降解為CO2和水。該菌株具有較好的溫度適應(yīng)性以及對(duì)甲酸乙酯的高效降解性，具有一定的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。