李麗 嚴月根 吳華明

（博瑞德環(huán)境集團股份有限公司，南京 210048）

水體氮元素污染本質(zhì)上是水體中含氮量超過環(huán)境承受的限值而造成的一系列現(xiàn)象和結(jié)果。未處理的廢水中，氮元素主要存在形式為有機氮和氨氮，二級生化處理后，氮元素的主要存在形式是氨氮和硝態(tài)氮。水體中氮元素污染的主要危害有：引發(fā)水體黑臭［1-3］；引起水體富營養(yǎng)化［4-6］以及對水生生物造成傷害［7］。

水體脫氮常見的方法有物理法、化學(xué)法、生物法［8］。物理法有氨的空氣吹脫法、電滲析法、反滲透法等，化學(xué)法有折點加氯法、選擇性離子交換法、磷酸銨鎂沉淀法等，生物脫氮法有傳統(tǒng)硝化-反硝化、短程硝化反硝化、厭氧氨氧化等。物理化學(xué)脫氮方法成本高、易產(chǎn)生二次方法，生物法投資運行費用低、環(huán)境友好，是理想的脫氮方式。

本實驗室從活性污泥中分離出一株具有良好反硝化脫氮活性的菌株M1，經(jīng)16S rDNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢具有極強的抗逆性，可耐高溫、輻射等惡劣條件，提高解淀粉芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量，有利于提升微生物菌劑的穩(wěn)定性和壽命。為了進一步提高M1菌株液體發(fā)酵產(chǎn)芽孢量的水平，本研究運用單因子實驗和正交試驗，優(yōu)化芽孢桿菌M1的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，并考察了該菌株對實際廢水的生物脫氮效果，為該菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本實驗室從活性污泥中分離并保存的解淀粉芽孢桿菌M1，其具有良好的反硝化脫氮活性。

1.1.2 主要儀器和試劑 蔗糖、硫酸銨、尿素、丁二酸鈉、氯化鈉等，分析純AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、瓊脂粉等，生化試劑BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉等，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

ZQZY-AF8組合式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；HQ40d pH計，瑞士梅特勒公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KH-300DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SWCJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；WGLL-230BE電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 M1菌株斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基。

LB培養(yǎng)基組成為：10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl，調(diào)節(jié)pH為7.2，120℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體LB培養(yǎng)基，瓊脂含量為20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株M1培養(yǎng)方法 菌種活化方法：將保存的菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，30℃活化24 h。

種子液培養(yǎng)方法：用接種環(huán)挑取1環(huán)菌泥，接入裝有10 mL LB培養(yǎng)基的50 mL搖瓶中，30℃活化22 h。

菌株培養(yǎng)方法：采用裝有100 mL LB培養(yǎng)液的250 mL搖瓶培養(yǎng)，接種量1%，于30℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，取樣測定活菌數(shù)和芽孢數(shù)。

1.2.2 芽孢計數(shù)法 采用平板計數(shù)法［9］，計數(shù)前將菌液在80水浴中熱處理15 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的單因子篩選 在LB培養(yǎng)基和30℃、200 r/min培養(yǎng)條件下，考察不同營養(yǎng)成分及濃度對M1液體發(fā)酵產(chǎn)芽孢量的影響。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3.1 碳源種類 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中原有成分不變的前提下，分別添加10 g/L甘露醇、蔗糖、麥芽糊精、海藻糖、乙酸鈉、木薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖、丁二酸鈉，選擇最優(yōu)碳源。

1.2.3.2 碳源濃度的選擇 上述篩選得到的最佳碳源，考察其濃度（5、10、15、20、25和30 g/L）對菌株M1液體發(fā)酵產(chǎn)芽孢量的影響。

1.2.3.3 氮源種類 以可溶性淀粉為碳源，分別添加10 g/L的硝酸鉀、硫酸銨、尿素作為單一氮源及1∶1、1∶2、1∶3的胰蛋白胨和酵母粉作為混合氮源加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，篩選最優(yōu)氮源。

1.2.3.4 氮源濃度的選擇 上述篩選得到的最佳氮源，考察其濃度（5、10、15、20、25和30 g/L）對菌株M1液體發(fā)酵產(chǎn)芽孢量的影響。

1.2.3.5 NaCl濃度的選擇 改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選中的 NaCl濃度（1、3、5、7、10、15和 20），篩選出最優(yōu)的NaCl濃度。

1.2.4 最佳培養(yǎng)條件的篩選 在LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間為48 h的條件下，研究接種量（0.5%、0.75%、1%、2%、5%、7%和10%）、裝液量（25、50、75、100 和 125 mL）、pH（6.5、7、7.5、8、8.5 和 9）、培養(yǎng)溫度（24、28、32、36和40℃）和轉(zhuǎn)速（120、140、160、180和200 r/min）對菌株M1液體發(fā)酵的影響。每個處理重復(fù)3次。

1.2.5 正交試驗 根據(jù)單因子試驗結(jié)果，選擇對菌株M1產(chǎn)芽孢量影響顯著的溫度、裝液量、接種量、氮源濃度為考察因素，按正交試驗表L9（34）設(shè)計4因素、3水平的正交試驗（表1），比較各種發(fā)酵條件組合對菌株M1產(chǎn)芽孢量的影響。其他試驗條件：可溶性淀粉 5 g/L，NaCl 1 g/L，初始pH值6.5，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，酵母粉：胰蛋白胨=2∶1。

1.2.6 反硝化脫氮實驗裝置 實驗采用自制SBR反應(yīng)器，反應(yīng)器有效容積為2 L，高200 mm，內(nèi)徑140 mm。反應(yīng)裝置在30℃恒溫水浴下運行，攪拌方式為磁力攪拌。

1.2.7 污泥特性及污水水質(zhì) 實驗接種污泥取自南京市某污水處理廠缺氧池，該污泥的MLSS濃度為7 800 mg/L，MLVSS/MLSS為0.90，呈紅褐色。將此活性污泥用紗布過濾除去塑料袋、石子等雜物，用蒸餾水清洗3次，按接種濃度3000-4000 mg/L接種。

實驗廢水取自同一污水處理廠勻質(zhì)池出水，水質(zhì) 特 征 為 pH=7.45，COD=11000 mg/L，TOC=2634mg/L，TN=1284 mg/L，NO3--N=1281 mg/L，TP=1.0 mg/L。將此污水稀釋10倍，作為實驗用水。

活性污泥經(jīng)20 d馴化，運行穩(wěn)定后，開始反硝化脫氮評價實驗。

1.2.8 評價方法 采用前述優(yōu)化工藝，搖瓶發(fā)酵制備M1菌液，在3 000 r/min條件下離心10 min，收集菌泥，生理鹽水洗滌2次。分別考察不同的投加量（0.5%、0.7%、1%、3%和5%）及不同的HRT（2、4、6、8和10 h）對反硝化脫氮效果的影響。

1.2.9 分析方法 NO3--N、MLSS、MLVSS等按標(biāo)準(zhǔn)方法［10］測定。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2007繪圖，用SPSS22分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間分別為24、36、48、60和72 h時，對應(yīng)的活菌數(shù)分別為：8.3×107、2.58×108、3.2×108、3.3×108和2.88×108CFU/mL，對應(yīng)的芽孢數(shù)分別為：7.8×107、1.58×108、2.08×108、1.72×108和 1.55×108CFU/mL，芽孢數(shù)在48 h時達到最大值，故選擇48 h作為發(fā)酵時間。

2.2 單因素試驗

2.2.1 碳源種類的篩選 由圖1可知，不同種類的碳源對芽孢桿菌M1活菌數(shù)及產(chǎn)芽孢量的影響很大（P＜0.05），其中可溶性淀粉、玉米淀粉、麥芽糊精能明顯促進菌株M1生長，木薯淀粉、丁二酸鈉、海藻糖對菌株M1生長影響不明顯（P＞0.05），甘露醇、蔗糖、葡萄糖不利于菌株M1生長（P＜0.05）。木薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉利于芽孢形成，馬鈴薯淀粉、丁二酸鈉對芽孢的形成無明顯影響，麥芽糊精對芽孢的形成有輕微的抑制作用（P＞0.05），葡萄糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖不利于芽孢的產(chǎn)生（P＜0.05）。

綜合考慮M1菌株活菌數(shù)及芽孢數(shù)，可以確定可溶性淀粉為菌株M1最佳碳源。

圖1 不同碳源對M1菌株發(fā)酵的影響

2.2.2 可溶性淀粉濃度的優(yōu)化 可溶性淀粉濃度分別為5、10、15、20、25及30 g/L時，菌株M1活菌數(shù)從 3.2×108CFU/mL、依次降至 2.4×108、2.2×108、2.5×108、2.2×108和 2.1×108CFU/mL，芽孢數(shù)從2.2×108CFU/mL、 依 次 降 至 1.4×108、1.3×108、1.2×108、1.2×108和 1.1×108CFU/mL。5 g/L 為 可溶性淀粉最優(yōu)添加濃度，此時活菌數(shù)和芽孢數(shù)達到最大值。

2.2.3 氮源的篩選 由圖2可知，不同氮源對M1菌株活菌數(shù)及產(chǎn)芽孢數(shù)具有顯著的影響（P＜0.05）。當(dāng)酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1時，M1菌株活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達到最大值，其次是酵母粉：胰蛋白胨=1∶1，當(dāng)酵母粉：胰蛋白胨=3∶1時，與空白對照相比，活菌數(shù)略微降低，芽孢數(shù)升高（P＞0.05），硝酸鉀、硫酸銨、尿素不利于M1菌株生長和芽孢產(chǎn)生（P＜0.05）。綜合考慮M1菌株活菌數(shù)和芽孢產(chǎn)量，以酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1作為優(yōu)選氮源。

圖2 不同氮源對M1菌株發(fā)酵的影響

2.2.4 優(yōu)選氮源濃度的優(yōu)化 按照2.2.3中研究結(jié)果，以酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1作為氮源，考察不同的氮源濃度對菌株M1發(fā)酵培養(yǎng)的影響（圖3）。隨著氮源濃度的增加，菌株M1的活菌數(shù)和芽孢數(shù)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，在氮源濃度為10 g/L時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)達到最大值。當(dāng)?shù)礉舛取?5 g/L時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)迅速下降。以芽孢數(shù)為參考指標(biāo)，優(yōu)選的氮源濃度為 10 g/L。

2.2.5 NaCl濃度的優(yōu)化 NaCl濃度對M1菌株活菌數(shù)和芽孢數(shù)都有顯著影響。當(dāng)NaCl濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%、15%和20%時，M1菌株的活菌數(shù)分別為：4.8×108、6.8×108、4.8×108、4.4×108、4.0×108、5.9×108和 6.2×108CFU/mL，芽孢數(shù)分別為：2.6×108、2.5×108、2.1×108、1.8×108、1.7×108、1.7×108和1.7×108CFU/mL。M1菌株的芽孢數(shù)隨著NaCl濃度的增加，逐漸減少。以芽孢產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)，最優(yōu)的NaCl濃度為1 g/L。

2.2.6 初始pH的篩選 當(dāng)初始pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9時，菌株的活菌數(shù)分別為：5.6×108、7.1×108、6.4×108、7.2×108、5.2×108和 6.4×108CFU/mL，芽孢數(shù)分別為：2.3×108、1.8×108、1.7×108、1.6×108、1.6×108、1.5×108CFU/mL。以芽孢產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)，最佳的初始pH值為6.5。

圖3 氮源濃度對M1菌株發(fā)酵的影響

2.2.7 最佳裝液量的篩選 裝液量對M1菌株活菌數(shù)和芽孢量的影響見圖4。M1菌株活菌數(shù)隨著裝液量的增加呈現(xiàn)先減少后增大的趨勢，在裝液量為50 mL時達到最大值。M1菌株的芽孢量隨著裝液量的增加呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，在裝液量為50 mL時，芽孢數(shù)和芽孢產(chǎn)率最高，分別為3.1×108CFU/mL和62%，在250 mL三角瓶中，最佳裝液量為50 mL。

圖4 裝液量對M1菌株發(fā)酵的影響

2.2.8 培養(yǎng)溫度的篩選 溫度對菌株M1活菌數(shù)和芽孢數(shù)具有顯著的影響（圖5）。隨著溫度的升高，菌株M1的活菌數(shù)和芽孢數(shù)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，在溫度為32℃時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)最大，因此，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為32℃。

2.2.9 搖床轉(zhuǎn)速的篩選 搖床轉(zhuǎn)速分別為120、140、160、180和200 r/min時，菌株M1活菌數(shù)分別為2.07×108、2.1×108、2.38×108、3.08×108和 2.17×108CFU/mL， 芽 孢 數(shù) 分 別 為 1.05×108、1.17×108、1.43×108、2.40×108和 1.95×108CFU/mL。優(yōu)選的轉(zhuǎn)速為180 r/min，此時活菌數(shù)和芽孢數(shù)達到最大。

圖5 溫度對M1菌株發(fā)酵的影響

2.2.10 接種量的篩選 不同接種量對M1菌株發(fā)酵影響見圖6。在接種量為7%時，活菌數(shù)及芽孢數(shù)達到最大，為2.53×108CFU/mL，高于或低于接種量7%，均不利于芽孢的產(chǎn)生。故選擇7%為最優(yōu)接種量。

圖6 接種量對M1菌株發(fā)酵的影響

2.3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

上述2.2中考慮了各因素對M1菌種發(fā)酵水平的影響，挑選其中對產(chǎn)芽孢量影響較為顯著的影響因子初始溫度（A）、裝液量（B）、接種量（C）和氮源濃度（D），按正交試驗表L9（34）設(shè)計4因素、3水平的正交試驗，進一步確定影響M1菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的實驗條件。正交試驗影響因素水平見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1 L9（34）正交試驗影響因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果表

從表2中的實驗結(jié)果可知，各因素對M1菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)的影響次序為：C＞B＞A＞D，最優(yōu)方案為A3B3C2D1，即發(fā)酵溫度34℃，裝液量75 mL，接種量7%，氮源濃度10%，此時菌粉芽孢數(shù)為6.8×108CFU/mL。采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)，發(fā)酵制備芽孢桿菌M1，芽孢數(shù)量高于優(yōu)化前的2.08×108CFU/mL。

2.4 反硝化脫氮評價實驗結(jié)果

不同投加量對反硝化脫氮影響較大，隨著投加濃度的增加，反硝化脫氮效果不斷提升。當(dāng)投加量超過1%時，反硝化脫氮效果提升幅度不明顯（圖7）。當(dāng)HRT≥10 h，所有實驗組中硝態(tài)氮完全去除。當(dāng)投加量為1%時，HRT分別為2 h、4 h和6 h時，與空白組相比，加入菌種M1后，系統(tǒng)反硝化脫氮活性分別提升15%、27%和34%。實驗說明，系統(tǒng)加入菌種M1后，對反硝化脫氮生物增效作用明顯，M1具備良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

圖7 投加量對反硝化脫氮效果的影響

3 討論

解淀粉芽孢桿菌可應(yīng)用于環(huán)保、生物農(nóng)藥、養(yǎng)殖和畜產(chǎn)品加工等領(lǐng)域。不同研究者對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究的結(jié)果不盡相同［11-14］，其原因可能是具體菌株不同、研究目的不同。培養(yǎng)基組分和操作條件對解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵具有重要影響，張子豪［15］等發(fā)現(xiàn)最佳碳源為淀粉，氮源為質(zhì)量比為1∶1∶2的酵母浸出物、胰蛋白胨和尿素。汪晶晶等［16］發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏、pH為7.0，發(fā)酵溫度28℃。李鑫等［17］發(fā)現(xiàn)最佳的發(fā)酵溫度為37℃、初始pH為7.0。曹雪梅等［18］發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的碳源為糊精、氮源為牛肉膏、溫度28℃，pH為7.0。He等［19］發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的pH為6.2，溫度為37℃。王卉等［20］發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為32℃時，活菌數(shù)最大。前述解淀粉芽孢桿菌優(yōu)選的初始pH值一般在中性及偏酸性條件下，與本工作結(jié)果相同。本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基組分為5 g/L碳源（可溶性淀粉）、10 g/L 氮源（酵母粉∶胰蛋白胨=2∶1）、1 g/L NaCl，培養(yǎng)條件為初始pH 6.5、發(fā)酵溫度34℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)瓶裝液量30%、接種量7%時，M1活菌數(shù)和芽孢數(shù)較優(yōu)化前分別提升了1.2、2.3倍。本工作僅對菌株M1的搖瓶發(fā)酵條件做了較為基礎(chǔ)的研究，后續(xù)還需要進行發(fā)酵罐小試和中試實驗，對發(fā)酵過程進行控制優(yōu)化［21］，同時需要考察消泡劑、無機鹽［22］等因素對發(fā)酵的影響。

生物脫氮具有環(huán)保、經(jīng)濟的特點，在治理水體富營養(yǎng)等領(lǐng)域具有較為廣泛的應(yīng)用［23-26］。本工作采用優(yōu)選的發(fā)酵條件，發(fā)酵制備M1菌液，離心洗滌、濃縮后，投加量為1%，HRT分別為2 h、4 h和6 h時，與空白組相比，系統(tǒng)反硝化脫氮活性分別提升15%、27%和34%。實驗說明反硝化脫氮菌M1具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。后續(xù)需要做更為系統(tǒng)的實驗，詳細考察菌株M1的反硝化脫氮特性。