周敏雅 陸睿 張婷 袁婷婷 盧瑤瑤 嚴(yán)坤寧 袁玉國(guó) 成勇

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是廣泛存在于生物界的一類金屬酶，它能清除機(jī)體內(nèi)多余的活性氧。哺乳類動(dòng)物和人體內(nèi)僅含Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）及 EC-SOD（SOD3），其中SOD1和 SOD3 同屬于Cu/Zn-SOD，前者存在于細(xì)胞內(nèi)，后者位于細(xì)胞外液中［1］。據(jù)報(bào)道［2］，在哺乳動(dòng)物體內(nèi) Cu/Zn-SOD 的穩(wěn)定性和含量均高于Mn-SOD，因此Cu/Zn-SOD在臨床應(yīng)用上更受重視。

隨著人們對(duì)高質(zhì)量生物制品的需求日益增大，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的重組蛋白開(kāi)始不斷涌現(xiàn)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比［3］，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器具有高表達(dá)、高生物學(xué)活性、蛋白翻譯后可修飾及不產(chǎn)生內(nèi)毒素等優(yōu)勢(shì)，是極具發(fā)展前景的制藥新途徑之一。本實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)功能性蛋白的技術(shù)已較成熟［4-5］，其中Song（宋紹征）等［6］在轉(zhuǎn)基因兔乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)重組人纖溶酶原激活劑的研究中，rhPA 濃度最高可達(dá) 630 μg/mL，表達(dá)產(chǎn)物比活性是現(xiàn)有阿替普酶的 360 倍。由此可見(jiàn)，乳腺生物反應(yīng)器具有生物活性高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。

目前，能利用宿主生物體來(lái)表達(dá)多種異源蛋白的方法有共整合［7］和元表達(dá)載體系統(tǒng)［8］，前者是轉(zhuǎn)基因通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribozyme entry site，IRES）連接，但不同的基因之間總是影響彼此的表達(dá)；通常是5'區(qū)相對(duì)高于3'區(qū)，而且每個(gè)基因的表達(dá)水平均會(huì)相對(duì)低于單基因整合個(gè)體。然而，在二元載體系統(tǒng)中，這兩個(gè)載體具有獨(dú)立的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)，不存在彼此影響。因此，我們選用二元載體系統(tǒng)開(kāi)展研究。此外，為提高轉(zhuǎn)基因效率，我們嘗試僅用一個(gè)載體含標(biāo)記基因來(lái)篩選獲得雙載體共轉(zhuǎn)染的重組陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，并通過(guò)體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)生產(chǎn)雙轉(zhuǎn)基因克隆山羊。

在本研究中，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、Western blotting和體外活性實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)到rhSOD1和rhSOD3能在山羊乳汁中有效表達(dá)，從而表明成功構(gòu)建了攜帶山羊 β-酪蛋白/CMV 雜合啟動(dòng)/增強(qiáng)子優(yōu)化的hSOD1和hSOD3編碼序列的二元表達(dá)載體。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)rhSOD1、rhSOD3蛋白是可行的，為后續(xù)純化和大批量生產(chǎn)rhSOD蛋白提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺特異性表達(dá)載體 山羊乳腺特異性表達(dá)載體以山羊beta酪蛋白為表達(dá)調(diào)控序列，雞beta珠蛋白為隔離原件，CMV為增強(qiáng)子；hSOD1、hSOD3 cDNA為功能基因，序列來(lái)自NCBI，編號(hào)分別如下：

1.1.2 試劑 內(nèi)切酶、Taq酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；T4 DNA連接酶，購(gòu)自美國(guó)Promega公司；G418培養(yǎng)基（E859，Amresco，美國(guó)）；膠回收純化試劑盒（D2500-01，OMEGA，美國(guó)）；FSH（110044629，寧波三生藥業(yè)有限公司）；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Pall公司；ElISA試劑盒等購(gòu)自上海生工；其他試劑無(wú)特殊說(shuō)明，均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和器械 基因擴(kuò)增儀（S1000型，BIO-RAD，美國(guó)）；DNA電泳槽、電泳儀（NJ400型，南京新校園儀器）；Multiporator多功能細(xì)胞電轉(zhuǎn)染儀（Eppendorf，德國(guó)）；凝膠成像儀（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（SJ-CJ-1BQ型，蘇州凈化儀器設(shè)備廠）；倒置顯微鏡和顯微操作儀（Leica，德國(guó)），體視顯微鏡（廈門麥克奧迪公司），CO2培養(yǎng)箱（No.3111，F(xiàn)orma Science Inc. 美國(guó)），拉針儀（PB-7 Micropipette Puller，Narisgige，日 本），DNA 擴(kuò)增儀（S1000 Thermal Cycler，Bio-RAD，美國(guó)），酶標(biāo)儀（RT-6000，Rayto，深圳），醫(yī)用低溫保存箱（DW-86L626，青島海爾公司）；常規(guī)手術(shù)器械等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體成熟的山羊購(gòu)自江蘇省內(nèi)，飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建載體與回收片段 合成的hSOD1、hSOD3 cDNA序列（上海生工）插入至本實(shí)驗(yàn)室保存的含有上述表達(dá)調(diào)控元件的乳腺特異性表達(dá)載體pCL25的XhoI酶切位點(diǎn)處并在pCL25/hSOD1的NheI酶切位點(diǎn)處插入Neor基因，經(jīng)測(cè)序及序列結(jié)果比對(duì)，篩選獲得與理論序列一致的表達(dá)載體。構(gòu)建成的乳腺特異性表達(dá)載體命名為rhSOD1、rhSOD3（圖1）。rhSOD1和rhSOD3乳腺特異性表達(dá)載體分別以SalI+NotI雙酶切獲得16.8 kb和16.3 kb的真核表達(dá)基因片段［8］，經(jīng)膠回收試劑盒（D2500-01，OMEGA，美國(guó)）回收片段，分別溶于滅菌雙蒸水，以供細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2 應(yīng)用電轉(zhuǎn)染制備雙基因共整合的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞 從液氮灌中取出凍存的原代山羊胎兒成纖維細(xì)胞，復(fù)蘇培養(yǎng)至P2代，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿板底時(shí)，用細(xì)胞消化液（0.05% 胰酶+0.04% EDTA）消化收集細(xì)胞，離心后用低滲電轉(zhuǎn)染液（Eppendorf，德國(guó)）清洗并計(jì)數(shù)［9］；用電轉(zhuǎn)液懸浮細(xì)胞至細(xì)胞密度至2×106個(gè)/mL，分別加入4 μg 的rhSOD1 和rhSOD3片段，將混合液轉(zhuǎn)移至徑寬為2 mm電轉(zhuǎn)染杯（Eppendorf，德國(guó)），在 250 V，300 μs 條件下電擊 2 次，使rhSOD1、rhSOD3共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞。電轉(zhuǎn)染24 h后轉(zhuǎn)至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用G418（800 μg/mL，Amresco，美國(guó)）的抗性培養(yǎng)液培養(yǎng)，篩選10 d，將篩選到的單克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后收集1/4的細(xì)胞用于PCR整合檢測(cè)，剩余的細(xì)胞凍存于液氮中。

圖1 乳腺特異性表達(dá)載體 rhSOD1和rhSOD3

1.2.3 胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因檢測(cè) 用 60 μL/孔細(xì)胞裂解液（40 mmol/L Tris-HCl，pH 8.9）于 45℃裂解1 h，取 5 μL 作為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，檢測(cè)引物為 CMV-SOD 跨接頭引物 CMV-rhSOD1-C 組 和CMV-rhSOD3-C組見(jiàn)表1，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 制備雙基因共整合山羊 獲得的雙基因共整合的單克隆細(xì)胞株作為供核細(xì)胞，以MII期的山羊卵母細(xì)胞經(jīng)去核處理后作為核受體，進(jìn)行體細(xì)胞核移植，選擇狀態(tài)佳的重構(gòu)胚，移植到同期發(fā)情的受體山羊輸卵管中。術(shù)后一個(gè)月，通過(guò)B超檢測(cè)受體山羊的妊娠狀況。

1.2.5 出生的克隆山羊外源基因整合檢測(cè) 剪取出生小羊的耳尖皮膚，經(jīng)組織裂解液與蛋白酶K消化5 h 后，提取耳組織DNA。檢測(cè)引物為CMV-SOD 跨接頭引物 CMV-rhSOD1-G 組 和 CMV-rhSOD3-G組見(jiàn)表1。其中，rhSOD 1的 C組與G組的PCR 參數(shù)為：95℃ 預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，60℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共 33個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 10 min。

rhSOD 3的 C組與G組的PCR參數(shù)為：95℃ 預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 33個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 10 min。

表1 PCR檢測(cè)所用引物

1.2.6 Western blotting檢測(cè) 采集SOD-1 與正常山羊的乳汁樣品，離心（4℃，5 000 r/min，40 min）吸取乳清，盡量避免吸取下層渾濁物。取30 μL乳清和6 μL 6×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混勻，煮沸10-15 min，冷卻后依次加入凝膠孔內(nèi)，同時(shí)設(shè)置正常山羊乳清作為陰性對(duì)照，PBS作為空白對(duì)照，重組人SOD1（Thermo Fisher，美國(guó)）和重組人SOD3（CUSABIO，武漢）作為陽(yáng)性對(duì)照，運(yùn)行電泳使蛋白分離；再通過(guò)膜轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，將PVDF膜轉(zhuǎn)置于潔凈的平皿中加入 10 mL 含5% FBS的TBST封閉液，使其充分浸沒(méi)，4℃ 過(guò)夜封閉；第2天早上取出后用TBST沖洗3次；置于15 mL 以1∶2 000 稀釋的兔抗人 SOD1 或兔抗人 SOD3 抗體，37℃搖床孵育1.5 h 后TBST沖洗3次；再將膜浸沒(méi)于以1∶1 000稀釋的羊抗兔酶標(biāo)二抗IgG-HRP，37℃ 搖床孵育1.5 h后用TBST沖洗3次，通過(guò) TCL顯色并記錄。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中 rhSOD 的 ELISA 檢測(cè) 收集SOD-1和正常山羊第 5、10、15和20 d 的乳汁，離心（4℃，5 000 r/min，40 min）吸取乳清。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定 rhSOD1 和 rhSOD3 的表達(dá)水平，同時(shí)將 hSOD1 或 hSOD3 標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，正常山羊乳清為陰性對(duì)照，PBS為空白對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)選用兔抗人SOD1或兔抗人SOD3 作為一抗，使用時(shí)經(jīng)抗體稀釋液以1∶2 000比例稀釋，37℃孵育1 h；棄去一抗后，加入經(jīng)抗體稀釋液以1∶1 000 稀釋的羊抗兔酶標(biāo)二抗 IgG-HRP，37℃孵育1 h；通過(guò)TMB 顯色，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定 OD450值。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因山羊表達(dá)產(chǎn)物的體外活性檢測(cè) 用WST-8試劑盒測(cè)定羊奶中總的重組人SOD酶活性，實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在吸光度為450 nm 處，測(cè)OD值，并計(jì)算乳清中所含總的重組人SOD酶活性。

2 結(jié)果

2.1 獲得轉(zhuǎn)hSOD1、hSOD3基因的山羊胎兒成纖維細(xì)胞系

分別用5 μg的 rhSOD1、rhSOD3片段共轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞，通過(guò)用含G418的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選10 d，共獲得19株單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，經(jīng)PCR檢測(cè)后篩選出其中rhSOD1與rhSOD3雙基因整合的單克隆細(xì)胞株6株（其中rhSOD1、rhSOD3擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小分別為673 bp和414 bp）見(jiàn)表2。PCR鑒定結(jié)果，見(jiàn)圖2。

表2 胎兒成纖維細(xì)胞整合數(shù)據(jù)分析

圖2 胎兒成纖維細(xì)胞細(xì)胞系rhSOD1、rhSOD3基因的PCR檢測(cè)

2.2 雙基因整合克隆山羊的出生

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn) rhSOD1、rhSOD3 雙基因克隆羊。我們共進(jìn)行了2次克隆實(shí)驗(yàn)，超排6只供體山羊，獲得27枚MII期卵母細(xì)胞，得到23枚重構(gòu)胚，移植2只受體山羊。在術(shù)后35 d 通過(guò)B超檢查發(fā)現(xiàn)一只受體山羊呈妊娠陽(yáng)性，待自然分娩，產(chǎn)下一只雌性羔羊（圖3），記編號(hào)為SOD-1。

圖3 轉(zhuǎn)雙基因克隆山羊

2.3 克隆山羊的PCR檢測(cè)結(jié)果

提取SOD-1的基因組，通過(guò)PCR初步檢測(cè)及序列分析表明該克隆羊整合了 rhSOD1、rhSOD3 雙基因，其中rhSOD1、rhSOD3擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小分別為621 bp和592 bp。PCR檢測(cè)結(jié)果如圖 4。

圖4 rhSOD1、rhSOD3雙基因共整合山羊的檢測(cè)鑒定

2.4 rhSOD在乳汁中的特異性表達(dá)

轉(zhuǎn)基因山羊SOD-1和正常山羊的乳清經(jīng) Western blotting 檢測(cè)，結(jié)果（圖5）表明，在轉(zhuǎn)基因山羊SOD-1的奶樣中檢測(cè)到rhSOD1和 rhSOD3，而在正常山羊的奶樣中，沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白。rhSOD1和rhSOD3的大小分別約為16 kD 和32 kD。

2.5 轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中rhSOD 的ELISA檢測(cè)結(jié)果

SOD-1的乳清經(jīng) ELISA 檢測(cè)，檢測(cè)到 rhSOD1和 rhSOD3， 含 量 分 別 為 88.81± 8.36 mg/L和267.82± 12.67 mg/L。圖6、圖7和表3、表4中結(jié)果均為乳清樣品經(jīng)PBS稀釋10倍后實(shí)驗(yàn)所得。

圖5 Western blot檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因山羊乳中rhSOD的表達(dá)

圖6 rhSOD1的ELISA檢測(cè)圖

圖7 rhSOD3的ELISA檢測(cè)圖

表3 檢測(cè)乳清樣品中rhSOD1的濃度

表4 檢測(cè)乳清樣品中rhSOD3的濃度

2.6 轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中rhSOD的體外活性檢測(cè)

經(jīng)WST-8試劑盒檢測(cè)，結(jié)果（表5）顯示，轉(zhuǎn)基因山羊乳清中SOD總活性的平均值為1432±157 U/mL，正常山羊乳清的SOD活性為3.4 U/mL。表明該雙轉(zhuǎn)基因克隆山羊的表達(dá)產(chǎn)物具有較好的生物學(xué)活性。

表5 轉(zhuǎn)基因山羊乳清中rhSOD的酶活性

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的多數(shù) rhSODs是由大腸桿菌［10-11］、畢赤酵母［12］、釀酒酵母［13-14］、昆蟲(chóng)細(xì)胞［15］、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞［16］、植物［17-18］及雞［19］等系統(tǒng)表達(dá)，而應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器同時(shí)表達(dá)rhSOD1 和 rhSOD3 尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的hEC-SOD分子量約為32 kD，而hEC-SOD的理論分子量為26.7 kD，從兩者的差異來(lái)看，在轉(zhuǎn)基因山羊奶中表達(dá)的 hEC-SOD蛋白為該蛋白的糖基化形式［19］。研究發(fā)現(xiàn)，在山羊奶中檢測(cè)到的 rhSODs 與野生型hSODs具有相似的分子量和生物學(xué)活性，表明 rhSODs在乳腺上皮細(xì)胞中能正確折疊和進(jìn)行多種修飾，更接近天然結(jié)構(gòu)；同時(shí)，可以避免大腸桿菌系統(tǒng)中可能存在內(nèi)毒素污染問(wèn)題的發(fā)生［12，20］。與之相比，上述原來(lái)的表達(dá)系統(tǒng)還存在其他缺陷，如在畢赤酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白，其糖基化過(guò)程不是錯(cuò)誤的就是不完整的［21］。

山羊奶中某些氨基酸含量較高（特別是含硫），以及豐富的飽和短鏈脂肪酸和礦物質(zhì)（主要是K、Ca、Mg、Fe 和 Cu）。因此，與牛奶相比具有更高的緩沖容量和更豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［22］。1998年，Gui等［23］在SODs的穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)，采用經(jīng)典的巴氏殺菌法殺菌后仍然可以保持其生物活性，說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因羊奶可以用于生產(chǎn)鮮乳制品。2009年，Milesi等［24］報(bào)道口服SODs可能存在緩解疼痛的效果，尤其是在減輕壓力和緩解疲勞上。由此推出，口服含SODs的山羊奶具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與有益的護(hù)理作用。

雙載體系統(tǒng)在多種物種間都能有效表達(dá)，如大腸桿菌、果蠅［25-26］、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞［27］和家蠶［28］等。然而，在中大型動(dòng)物生物反應(yīng)器上運(yùn)用雙載體來(lái)表達(dá)重組蛋白是少見(jiàn)的。本研究構(gòu)建的雙載體表達(dá)系統(tǒng)在山羊乳腺中能有效表達(dá)，表明這兩個(gè)載體均保持完整，且獨(dú)立表達(dá)，互不影響。這是第一個(gè)在轉(zhuǎn)基因羊奶中同時(shí)表達(dá)具有生物活性的hCuZn-SOD和hEC-SOD的研究，并且轉(zhuǎn)基因克隆山羊及其后代沒(méi)有表現(xiàn)出異常，說(shuō)明我們的表達(dá)載體和rhSODs沒(méi)有影響山羊的正常生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖。

應(yīng)用可選擇標(biāo)記基因（Selectable marker gene，SMG）是篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊的關(guān)鍵步驟。目前的研究表明，僅用一種轉(zhuǎn)基因含標(biāo)記基因（SMG）來(lái)篩選出具有雙基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系是可以的。這一發(fā)現(xiàn)可以提高轉(zhuǎn)基因效率，減少工作量。例如，在我們的研究中hSOD1用新霉素抗性基因標(biāo)記，而hSOD3不采用標(biāo)記基因，兩者在共轉(zhuǎn)染后會(huì)出現(xiàn)4種情況：（1）只轉(zhuǎn)成功hSOD1；（2）只轉(zhuǎn)成功hSOD3；（3）hSOD1和hSOD3均轉(zhuǎn)成功；（4）均未轉(zhuǎn)失敗，但是空的。其中，能存活下來(lái)的只有情況1和3，大大縮短時(shí)耗。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)僅用一個(gè)載體含標(biāo)記基因的雙載體表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在我們的研究中，rhSOD1在3'位點(diǎn)有一個(gè)新霉素抗性基因，而rhSOD3沒(méi)有，將雙轉(zhuǎn)基因山羊與野生型公羊交配，以期獲得rhSOD3單基因整合的山羊不帶標(biāo)記基因。這將是在不需要SMG的情況下提高轉(zhuǎn)基因山羊上調(diào)基因的有效方法。

在本研究中，我們通過(guò)SCNT技術(shù)成功制備出能同時(shí)表達(dá)hSOD1和hSOD3轉(zhuǎn)基因克隆山羊。結(jié)果表明，將兩個(gè)獨(dú)立的載體共整合入供體細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有去分化和發(fā)育的潛力。

4 結(jié)論

本研究表明，整合了hSOD1或hSOD3功能基因的兩個(gè)乳腺特異性表達(dá)載體均可在轉(zhuǎn)基因山羊奶中表達(dá)，且重組蛋白保持其生物學(xué)活性。本研究通過(guò)一個(gè)載體標(biāo)記Neo基因的雙載體表達(dá)系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染到山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，獲得了雙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，并應(yīng)用體細(xì)胞核移植制備出雙轉(zhuǎn)基因山羊。在乳腺中表達(dá) rhSDODs 鮮有報(bào)道，本研究為未來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)rhSODs用于食品、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域開(kāi)辟了一條新路徑。