張澤華 高巍 鄔向麗 黃晨陽 常明昌 張金霞

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

桃 紅 側(cè) 耳［Pleurotus djamor（Rumph. ex Fr.）Boedijn］色澤鮮艷，是兼具食用、觀賞和藥用價值的食用菌［1-4］。子實(shí)體顏色是食用菌的重要商品性狀之一，已成為食用菌育種的重要方向。目前市場上的P. djamor一般為粉紅色、顏色較淺，選育顏色更深的P. djamor新品種需求強(qiáng)烈。

食用菌的許多重要農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、質(zhì)量和抗病性，都是受多基因遺傳控制的數(shù)量性狀［5-7］。子實(shí)體顏色遺傳規(guī)律也已在雙孢蘑菇、金針菇和白黃側(cè)耳等食用菌中開展諸多研究。廖建華等［8］研究發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）子實(shí)體顏色受一對基因控制，棕色為顯性、白色為隱性；Callac等［9］證明了A. bisporus菌蓋白色是由與乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）基因座連接的單一位點(diǎn)上的隱性等位基因控制；謝寶貴等［10］認(rèn)為金針菇（Flammulina velutipes）顏色黃色為顯性、白色為隱性，受一對基因控制；盛春鴿等［11］研究表明白黃側(cè)耳（Pleurotus cornucopiae）顏色性狀為數(shù)量性狀，深灰色對白色呈不完全顯性，由不同位點(diǎn)上的兩對主基因控制。目前對于P. djamor的研究，主要集中在人工栽培技術(shù)［12-14］、多糖提取工藝［15-16］、富硒紅平菇的研究［17］以及漆酶基因的克隆［18］、異源表達(dá)［19］和對染料的脫色能力［20-21］等方面，鮮見子實(shí)體顏色的相關(guān)研究。在資源挖掘的基礎(chǔ)上，本研究以粉紅色和灰褐色P. djamor為材料，經(jīng)雜交、測交，探索P. djamor子實(shí)體粉紅色性狀的遺傳學(xué)特征和規(guī)律，為食用菌的色澤育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：土豆200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.5 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水定容至1.0 L，121℃滅菌30 min。

再生培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，麥芽糖5.0 g，酵母粉5.0 g，甘露醇109.3 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水定容至1.0 L，121℃滅菌30 min。

出菇配方：棉籽殼94%（W/W），麩皮5%（W/W），石灰1%（W/W），含水量65%（W/W）左右，126℃滅菌2 h。

1.1.2 試劑 2%溶壁酶（購自廣東微生物研究所）：0.4 g溶壁酶加入到20.0 mL的0.6 mol/L甘露醇溶液，搖勻，用0.22 μL膜過濾除菌，備用。

1.1.3 親本菌株以P. djamor粉紅色菌株CCMSSC00450和灰褐色菌株CCMSSC04445為材料（圖1），以上菌株均保藏于國家食用菌標(biāo)準(zhǔn)菌株庫（China Center for Mushroom Spawn Standards and Control，CCMSSC）。

圖1 親本子實(shí)體顏色

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體單核化 引用潘迎捷［22］的方法將親本菌株進(jìn)行原生質(zhì)體單核化。

1.2.2 F1代雜交子 原生質(zhì)體單核化獲得的單核菌株進(jìn)行配對雜交，挑取接合部位菌絲，進(jìn)行鏡檢。將存在鎖狀聯(lián)合的菌株分離純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 栽培條件 出菇溫度：24-28℃，光照強(qiáng)度：100-500 lx，相對濕度：80%-95%（W/W）。

1.2.4 顏色性狀的測交群體構(gòu)建 根據(jù)黃毅［23］的方法收集單孢子單核體。選取F1代中目的菌株的單孢單核體分別與粉紅色親本中攜帶隱性基因的單核體進(jìn)行雜交，鏡檢是否存在鎖狀聯(lián)合，將存在鎖狀聯(lián)合的菌株分離純化，保存?zhèn)溆茫糜跇?gòu)建子實(shí)體顏色的測交群體。

1.2.5 群體顏色測定 選取成熟期的子實(shí)體，用分光測色儀（CM-700d，日本Konica Minolta）對菌蓋和菌褶顏色進(jìn)行測量。每個菌株取3個子實(shí)體，每個子實(shí)體取3個測量位點(diǎn)，每次測量重復(fù)3次取平均值。采用Weijn［24］的方法用公式WI=L-3b將測得的三色空間坐標(biāo)L、a、b數(shù)值中的L、b轉(zhuǎn)化為WI（Whitness Index）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用IBM SPSS Statistics 21軟件中LSD模型對分離群體子實(shí)體菌蓋和菌褶的顏色性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時采用一般線性模型進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算廣義遺傳力（Broad-sense heritability）。K-S檢驗(yàn)分析菌蓋和菌褶的顏色性狀是否符合正態(tài)分布，Pearson相關(guān)性分析菌蓋顏色和菌褶顏色是否有相關(guān)性。廣義遺傳力計(jì)算公式為：［25］。其中H2為廣義遺傳力，是遺傳因素引起的變異是誤差變量，r是試驗(yàn)重復(fù)數(shù)（r=1）。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體單核菌株的獲得

通過原生質(zhì)體單核化獲得親本菌株CCMSSC00450和CCMSSC04445的組成型單核菌株，分別編號為PDm52和PDm17，PDm99和PDm14。

2.2 F1代雜交子的獲得

粉紅色親本CCMSSC00450的兩個組成型單核菌株P(guān)Dm52和PDm17分別與灰褐色親本CCMSSC04445的兩個組成型單核菌株P(guān)Dm99和PDm14配對雜交，得到4種雜交子：PDm52×PDm99、PDm52×PDm14、PDm17×PDm14和PDm17×PDm99，顏色分別表現(xiàn)為粉紅色、粉灰色、灰褐色和白色（圖2）。根據(jù)雜合子的表型從而推斷雙親顏色遺傳基因的純合度。其中F1代出現(xiàn)了與親本不同的顏色，即粉灰色（PDm52×PDm14）和白色（PDm17×PDm99），證明親本所攜帶的控制顏色的遺傳基因是雜合的。粉紅色和灰褐色相對于白色為顯性，白色為隱性。

2.3 測交群體構(gòu)建及表型鑒定

選取F1代中粉紅色表型明顯的菌株P(guān)Dm52×PDm99，收集到207個單孢子單核體，作為分離群體。以PDm17為測交菌株，構(gòu)建測交群體。

對測交群體中各菌株的菌蓋和菌褶顏色性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析見表1。WI值越小，顏色越深；反之，顏色越淺。菌蓋WI值有極顯著性差異（P＜0.01），測交群體中有49個菌株（24%）菌蓋顏色WI值小于粉紅色親本菌株（00450）WI值（41.11）（圖3-A）；菌褶WI有極顯著性差異（P＜0.01），測交群體中有51個菌株（25%）菌褶顏色WI值小于粉紅色親本菌株（00450）WI值（29.94）（圖3-B），兩者數(shù)據(jù)表明測交群體中出現(xiàn)了較明顯的超親分離現(xiàn)象，存在多個比粉紅色親本（00450）子實(shí)體的顏色更深、更紅的菌株。另外，群體中菌蓋顏色和菌褶顏色都有較高的變異系數(shù)（CVcap=26.82%，CVgill=37.63%），表明子實(shí)體顏色有顯著的性狀分離現(xiàn)象。

子實(shí)體顏色出現(xiàn)明顯的性狀分離，從粉紅色、淡粉色到白色，顏色由深到淺（圖4）呈連續(xù)型分布，說明粉紅色對于白色為不完全顯性；P. djamor子實(shí)體顏色是由多基因控制的數(shù)量性狀，而這些基因在形成子代群體（207個菌株）過程中發(fā)生了分離。

圖2 親本和F1代子實(shí)體顏色

2.4 測交群體顏色性狀的遺傳特點(diǎn)

對測交群體子實(shí)體菌蓋和菌褶的顏色WI值進(jìn)行K-S檢驗(yàn)。菌蓋顏色檢驗(yàn)結(jié)果漸進(jìn)顯著性Asym Sig.（2-tailed）=0.805＞0.05，菌褶顏色檢驗(yàn)結(jié)果漸進(jìn)顯著性 Asym Sig.（2-tailed）=0.447＞0.05，說明菌蓋和菌褶顏色性狀的WI值均符合正態(tài)分布（圖5），表明該性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀。

表1 測交群體顏色性狀（WI）統(tǒng)計(jì)特征

圖3 測交群體菌蓋（A）和菌褶（B）WI值柱狀圖

圖4 測交群體子實(shí)體顏色

測交群體菌蓋和菌褶WI值A(chǔ)NOVA分析見表2。結(jié)果表明，P. djamor子實(shí)體菌蓋和菌褶顏色兩個性狀均是由遺傳因素決定的（P＜0.01）。菌蓋顏色性狀的廣義遺傳力H2=0.88，菌褶顏色性狀的廣義遺傳力H2=0.91，表明顏色性狀為高度可遺傳的性狀，基因型是使顏色表型變異的主要因素。

根據(jù)測交群體子實(shí)體菌蓋顏色和菌褶顏色的Pearson相關(guān)性分析，菌蓋顏色和菌褶顏色之間存在極顯著相關(guān)性（r=0.990，P＜0.01，n=109）。

圖5 菌蓋（A）和菌褶（B）顏色WI值的頻率分布

表2 測交群體菌蓋和菌褶WI值A(chǔ)NOVA分析

3 討論

本研究利用傳統(tǒng)的雜交和測交技術(shù)對P. djamor顏色的遺傳規(guī)律進(jìn)行了分析。根據(jù)親本組成型單核體間雜交配對出菇結(jié)果，選擇F1代粉紅色雜交子（PDm52×PDm99）的擔(dān)孢子單核子代菌株作為分離群體，分析粉紅色和白色相對性狀的遺傳和分離規(guī)律。因?yàn)榘咨珵殡[性性狀，故選擇攜帶白色隱性性狀的單核菌株P(guān)Dm17為測交菌株。F1粉與PDm17構(gòu)建的測交群體中出現(xiàn)了不同程度的粉色甚至比親本更深。由于個體間微弱的顏色差別難以使用肉眼進(jìn)行區(qū)分，采用CM-700d分光測色儀對其進(jìn)行數(shù)據(jù)化統(tǒng)計(jì)達(dá)到了區(qū)分目的。與本研究結(jié)果相似，謝寶貴等［10］對F. velutipes顏色遺傳規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，子實(shí)體顏色出現(xiàn)了淺黃、黃、深黃等，呈連續(xù)分布，認(rèn)為是遺傳因子“串聯(lián)”在一起的生化反應(yīng)結(jié)果。盛春鴿等［11］認(rèn)為P. cornucopiae顏色遺傳規(guī)律具多基因加性效應(yīng)，每個微效基因的增加或減少都會導(dǎo)致子實(shí)體顏色深淺的不同。由于P. djamor和P.cornucopiae同屬側(cè)耳屬（Pleurotus），從研究結(jié)果看，以數(shù)量性狀分析更為合理。推測P. djamor顏色遺傳規(guī)律可能與P. cornucopiae類似，不同程度顏色的出現(xiàn)是因?yàn)槠渌z傳因子參與了顏色的形成，具有基因加性效應(yīng)，中間色澤的產(chǎn)生證明粉紅色對白色是不完全顯性遺傳。

P. djamor的野生資源是研究食用菌顏色變異的重要來源之一。本研究中，測交群體部分菌株能形成原基但不能繼續(xù)分化形成子實(shí)體，可能是由于子實(shí)體發(fā)育的相關(guān)基因下調(diào)或者丟失［26］。此外，部分菌株的出菇時間明顯縮短，是研究出菇、發(fā)育等相關(guān)性狀的理想材料。

然而目前關(guān)于食用菌的基因功能驗(yàn)證技術(shù)方法未獲得突破，食用菌遺傳規(guī)律研究進(jìn)展緩慢。但是，隨著基因敲除以及RNAi和CRISPR等技術(shù)［27-30］在真菌中的應(yīng)用，深入挖掘與顏色形成或控制顏色形成相關(guān)的基因或通路、闡明食用菌子實(shí)體顏色形成規(guī)律已經(jīng)成為可能。

4 結(jié)論

P. djamor子實(shí)體顏色粉紅色對白色為不完全顯性，白色為隱性，是具有高遺傳力的多基因控制的數(shù)量性狀；菌褶顏色比菌蓋顏色更深，兩者之間有極強(qiáng)相關(guān)性，本研究為食用菌子實(shí)體顏色遺傳研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)和理論支撐。