徐林娜 胡孟可 童文艷 李芬

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的定向運(yùn)輸由分子馬達(dá)完成。驅(qū)動(dòng)蛋白是一類(lèi)非常重要的分子馬達(dá)，主要以二聚體形式存在，包括馬達(dá)頭部、莖部、連接頭部與莖部的頸鏈以及與“貨物”相結(jié)合的尾部4個(gè)部分［1］。已知的驅(qū)動(dòng)蛋白種類(lèi)繁多［2-4］功能多樣，不僅參與細(xì)胞內(nèi)多種成分的定向運(yùn)輸，對(duì)大腦發(fā)育、記憶功能提升及神經(jīng)元活性等也非常重要［5-6］。驅(qū)動(dòng)蛋白的諸多功能均與其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（Coiled-coil，CC）存在于多種天然蛋白質(zhì)中，典型的CC由兩股右手α螺旋鏈以左手螺旋形式相互纏繞而成，在該結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基（aa）每旋轉(zhuǎn)兩圈形成一個(gè)七肽單元重復(fù)序列，7個(gè)aa依次表示為 a、b、c、d、e、f、g，其中 a、d位多為非極性疏水氨基酸常特異性地位于卷曲螺旋的內(nèi)側(cè)，e、g位多為極性帶電荷氨基酸常處在疏水核心的外側(cè)。這4個(gè)位置的氨基酸殘基對(duì)于整個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和特異性的維持非常重要［7-8］。

NtTkr是煙草驅(qū)動(dòng)蛋白超家族新成員，異于絕大多數(shù)泛表達(dá)的植物驅(qū)動(dòng)蛋白，僅在幼葉、發(fā)育各時(shí)期胚及其他分裂旺盛的組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控，與胚、種子大小及萌發(fā)有關(guān)［9］。NtTkr尾部共有3個(gè)CC結(jié)構(gòu)，CC1、CC2參與莖稈的形成，CC3識(shí)別并結(jié)合底物。本文通過(guò)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析和雙雜交檢測(cè)，探討了NtTkr 尾部CC3中T1084 缺失和替換突變對(duì)CC3結(jié)構(gòu)和靶蛋白相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

AH109、Y187菌 株、 質(zhì) 粒：pBI121-NtTkr、pGBKT7-NtTkrT大腸桿菌DH5α、pGBKT7、pGADT7等。

SD及缺陷培養(yǎng)基、X-α-Gal（Clontech 公司，美國(guó)）；KOD-plus高保真酶、dNTPs（2 mmol/L each）、10×KOD-plus buffer、25 mmol/L MgSO4（ToYoBo）；DNA markerλ-Eco T14、6×Loading buffer、限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒（Takara，日本）；質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN，北京）；鮭魚(yú)精DNA（上海浩然生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的擴(kuò)增與檢測(cè) 缺失和替換突變采用兩對(duì)引物的3輪PCR來(lái)完成，兩端引物為：P1：5'-cccggggatggtccctgtggaagg-3'、P2：5'-ggatcctatg cgttcctggtaaatggc-3'；含突變位點(diǎn)的中間互補(bǔ)引物分別為 ：T1084A P3：5'-ctcaacttaaagacgctgctgaagctgttc-3'、P4：5'-gaacagcttcagcagcgtctttaagttgag-3'；T1084d P3：5'-ctcaacttaaagacgctgaagctgttc-3'、P4：5'-gaacagcttcagc gtctttaagttgag-3'；P1和P2兩端分別引入SmaI和BamHI酶切位點(diǎn)，以pBI121NtTkr為模板，分別以P1、P3；P2、P4及 P1、P3；P2、P4為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物凝膠回收后等摩爾混合，取適量作為模板，以P1、P2為引物擴(kuò)增完整尾部片段。

1.2.2 誘餌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 凝膠電泳回收SmaI-BamHI線(xiàn)性化的pUC19和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂AMP+和x-gal 選擇平板。SmaI-BamHI雙酶切鑒定正確重組子并送去基因測(cè)序。將pGBKT7和測(cè)序正確的pUC19T1084d，pUC19T1084A分別進(jìn)行SmaI-BamHI雙酶切，回收7.3 kb的pGBKT7載體和各PCR片段，連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂Kan+ 選擇平板，SmaI-BamHI雙酶切鑒定。

1.2.3 酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法［10-11］將 8 μL pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A 和pGADT7-H2A/Sulfer/NT3分別加入50 μL制備的吸光度值為0.4-0.5的AH109及Y187感受態(tài)細(xì)胞，SD/-Trp或SD/-Leu平板篩選轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組質(zhì)粒對(duì)酵母宿主的毒性作用與自激活驗(yàn)證 按照Clontech操作說(shuō)明，將重組質(zhì)粒 pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A和空載體pGBKT7、pGADT7-H2A/Sulfer/NT3、pGADT7分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)AH109和Y187，在SD/-Trp或SD/-Leu選擇平板上分別挑取直徑大于2 mm的各轉(zhuǎn)化子單克隆接種至缺陷培養(yǎng)基：SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp-Ade/-His或 SD/-Leu、SD/-Leu/-His、SD/-Leu/-Ade以 及S D/-Leu/-Ade/-His，觀(guān)察生長(zhǎng)情況并檢測(cè)自激活作用；同法選取上述轉(zhuǎn)化子接種于50mL的SD/-Trp/+Kan或SD/-Leu/+Kan（20 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)定A600，檢測(cè)毒性作用。

1.2.5 酵母雙雜交鑒定 分別挑取直徑約2 mm的含pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A的AH109和含pGADT7-H2A/Sulfer/NT3的Y187克隆，共同接種于含0.5 mL YPDA培養(yǎng)液的1.5 mL離心管中，渦旋1min徹底打散混勻，30℃、30-50 r/min振蕩培養(yǎng)20-24 h后接種于SD/-Trp/-Leu平板，30℃倒置培養(yǎng)3-5d后挑取直徑約2 mm的二倍體單克隆于100 μL滅菌雙蒸水中混勻，取5 μL點(diǎn)樣于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-Gal平板，30℃倒置5d，觀(guān)察結(jié)果。

1.2.6 T1084d、T1084A點(diǎn)突變對(duì)蛋白互作影響的檢測(cè) 挑取轉(zhuǎn)入T1084d、T1084A和野生（T）單菌落于適量培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)測(cè)其濃度，梯度稀釋后接種適量細(xì)胞數(shù)（1 000，2 000，400個(gè)）于配制好的SD-Ade/-Trp/-His/-Leu+xα-gal平板上，30℃培養(yǎng)3-5 d。

2 結(jié)果

2.1 T1084d和T1084A的獲得及克隆入pUC19后的鑒定

以pBI121NtTkr為模板PCR擴(kuò)增1 kb和350 bp的T1083上下游片段（圖1-A）及兩片段搭接為模板PCR后獲得的T1084d、T1084A片段（圖1-B），與預(yù)期長(zhǎng)度相符。將T1084d、T1084A克隆入pUC19經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲重組子進(jìn)行SmaI-BamHI雙酶切鑒定得到了約1.32 kb的插入片段（圖1-C），與NtTkr尾部1 320 bp編碼區(qū)符合。測(cè)序結(jié)果顯示，編碼第1 084位蘇氨酸已經(jīng)缺失或?yàn)楸彼崽娲?/p>

2.2 T1084d、T1084A與BD融合誘餌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將測(cè)序正確的pUC19-T1084d、pUC19-T1084A和pGBKT7質(zhì)粒均用SmaI-BamHI雙酶切，回收1.32 kb的目的片段和7.3 kb的載體片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化并篩選得到重組子再進(jìn)行SmaI-BamHI的雙酶切鑒定，電泳結(jié)果（圖2-A）顯示得到了預(yù)期的片段，表明獲得了所需的T1084d和T1084A與BD融合誘餌表達(dá)質(zhì)粒。

2.3 誘餌表達(dá)質(zhì)粒和供試獵物質(zhì)粒的自激活實(shí)驗(yàn)和毒性檢測(cè)

分別轉(zhuǎn)化pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A和pGBKT7的AH109在SD/-Trp平板長(zhǎng)出的單克?。ㄖ睆剑? mm）數(shù)量與分別轉(zhuǎn)化pGADT7-H2A/Sulfer/NT3和pGADT7的Y187在SD/-Leu 平板長(zhǎng)出的單克?。ㄖ睆剑? mm）相似，均在45-50個(gè)之間；且含pGBKT7-NtTkrT/T1084d/T1084A 的 AH109（圖 3-A）和含 pGADT7-H2A/Sulfer/NT3 的Y187（圖3-B）分別只可在單缺培養(yǎng)基SD/-Trp和SD/-Leu上生長(zhǎng)，在不含His的二缺培養(yǎng)基上 AH109菌株有輕微的自激活現(xiàn)象，但在加入強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記Ade的二缺、三缺培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，表明在A(yíng)H109菌株中各質(zhì)粒雖有His報(bào)告基因的泄漏表達(dá)，但不能激活強(qiáng)選擇性標(biāo)記基因ADE表達(dá)。表明上述誘餌和供試靶蛋白可以在SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu+X-α-gal 篩選條件下用于酵母雙雜交分析。上述各轉(zhuǎn)化株在含20 μg/mL Kan的液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min培養(yǎng)16 h的A600均大于0.8，提示其對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)毒性，可用于酵母雙雜交檢測(cè)。

圖1 含T1084d和T1084A的獲得及克隆入pUC19后的鑒定

2.4 尾部?jī)煞N突變對(duì)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)及與靶蛋白相互作用的影響

Coiled-Coiled軟件分析表明NtTkr的T1084極性親水氨基酸蘇氨酸處于卷曲螺旋CC3的a位，將其替換為非極性的疏水氨基酸丙氨酸不僅增強(qiáng)HR結(jié)構(gòu)域的疏水性，還造成了卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的增長(zhǎng)，而T1084缺失則造成了卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的縮短（圖4-A）。上述兩突變誘餌與3個(gè)候選蛋白進(jìn)行蛋白互作的雙雜交檢測(cè)（圖4-B）顯示T1084A與野生T的情況接近，但是先于T顯示藍(lán)色并深于T，T1084d則明顯不如T的情況，與H2A的接合株表現(xiàn)尤為明顯。表明將1 084位T替換為A，增強(qiáng)HR結(jié)構(gòu)域的疏水性和七肽重復(fù)順序的長(zhǎng)度造成NtTKrp與候選蛋白互作的增強(qiáng)，而缺失T1084位縮短卷曲螺旋的長(zhǎng)度則造成其相互作用的減弱。且對(duì)于不同的靶蛋白上述突變對(duì)其相互作用影響程度不同。

圖2 誘餌表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-T1084d、pGBKT7-T1084A的酶切鑒定

圖3 誘餌和供試靶蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入AH109和Y187菌株的自激活實(shí)驗(yàn)

3 討論

NtTkr尾部的CC3（1049-1143 aa）結(jié)構(gòu)域中有個(gè)保守性基序 LIG-FHA-1［12］。FHA（Forkheadassociated domain）結(jié)構(gòu)域通過(guò)介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用，直接參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等過(guò)程［13-16］，LIG-FHA-1特定蘇氨酸殘基的磷酸化修飾對(duì)于蛋白結(jié)合是必需的，蘇氨酸殘基替換則會(huì)削弱蛋白間的相互作用［17］。磷酸化途徑目前已經(jīng)被證實(shí)是體內(nèi)驅(qū)動(dòng)蛋白活性調(diào)控的一種重要手段［18-20］。NtTkr尾部1084位保守的蘇氨酸的磷酸化如果也調(diào)節(jié)其與靶底物的結(jié)合，那么T1084的替換或缺失突變，必然也能引起NtKrp與候選蛋白相互作用的削弱。因此我們將野生、T1084缺失或被丙氨酸替代的尾部分別與篩選到的三個(gè)候選蛋白H2A、NT3和Sufer進(jìn)行酵母細(xì)胞內(nèi)互作分析，結(jié)果替換突變的互作明顯強(qiáng)于野生，而缺失突變T1084d互作減弱，表明NtTkr與上述3個(gè)蛋白的相互作用與FHA結(jié)構(gòu)域中保守蘇氨酸的磷酸化修飾無(wú)關(guān)。

圖4 T、T1084A和T1084d卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析及其與3個(gè)候選蛋白間相互作用檢測(cè)

NtTkr卷曲螺旋結(jié)構(gòu)T1084是極性親水氨基酸蘇氨酸位于七肽重復(fù)序列的a位。Lau等［21］將天然卷曲螺旋a、d位全部替換為疏水氨基酸，得到的蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)比天然的穩(wěn)定性更強(qiáng)。Monera等［22-23］研究發(fā)現(xiàn)丙氨酸在疏水核心中位置不同也可導(dǎo)致卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的改變。由此可知同Lau等一樣，將處于a位的極性親水蘇氨酸替換為非極性疏水丙氨酸增強(qiáng)了卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的疏水性和穩(wěn)定性，這可能就是T1084A最先顯現(xiàn)藍(lán)色，顏色深而且菌株生長(zhǎng)最好的原因。螺旋鏈的長(zhǎng)度也影響卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［24］，由圖4-A可知T1084的缺失突變使七肽重復(fù)序列縮短，因而會(huì)降低卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這也是T1084d生長(zhǎng)最差，顯色最淺的原因。此前本室曾將EGFP融合的NtTkr全長(zhǎng)和尾部轉(zhuǎn)入洋蔥表皮，二者均分布于胞質(zhì)，但轉(zhuǎn)入洋蔥表皮的T1084d、T1084A卻在胞質(zhì)和核中均有分布，而NtTkr本身并無(wú)核定位信號(hào)，其分布的改變顯然受與其結(jié)合的蛋白底物的影響。

4 結(jié)論

酵母雙雜交證實(shí)T1084缺失或替換可影響其與靶蛋白的結(jié)合強(qiáng)度，NtTkr與3個(gè)候選蛋白之間的相互作用與其尾部卷曲螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)，故它們?cè)诩?xì)胞中分布的改變很可能是NtTkr與底物相互作用的改變引起的。