趙 恬，柳 旭，周文楠，潘勝難，張鈺靖，鐘 元，蔣文博，王佺珍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

種子作為遺傳因素的載體之一，其品質(zhì)的優(yōu)劣對于農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)資源保存至關(guān)重要[1]。種子在生理成熟時活力達(dá)到頂峰，之后進入不可逆的老化(aging)過程[2]。老化不僅影響種子品質(zhì)和產(chǎn)量，還會對種質(zhì)資源的安全和遺傳完整性產(chǎn)生威脅[3-4]。種子在老化過程中體內(nèi)發(fā)生一系列的細(xì)胞代謝和生理生化反應(yīng)，如電解質(zhì)滲漏、質(zhì)膜完整性降低和脂質(zhì)過氧化程度加深、保護酶系統(tǒng)活性降低、DNA降解、線粒體結(jié)構(gòu)和功能損壞等[5-6]。關(guān)于種子老化機理，McDonald[7]和Simon[8]提出的老化自由基學(xué)說認(rèn)為，種子內(nèi)部自動氧化或在氧化酶的催化下產(chǎn)生自由基，自由基攻擊膜質(zhì)分子而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引起膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，細(xì)胞膜遭到破壞，透性增加[7-8]。相關(guān)研究表明，自由基導(dǎo)致的膜脂過氧化反應(yīng)是導(dǎo)致種子老化的主要原因[9-11]。此外，線粒體損傷衰老學(xué)說認(rèn)為，線粒體的電子傳遞鏈?zhǔn)腔钚匝?reactive oxygen species, ROS)的主要產(chǎn)生部位，種子在老化過程中產(chǎn)生大量ROS，引起細(xì)胞內(nèi)分子的氧化損傷，從而加速種子衰老[12]。

目前關(guān)于種子活力的修復(fù)方法有引發(fā)處理、營養(yǎng)元素調(diào)節(jié)、生長調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)、超聲波處理等[13-14]。超聲波 (頻率高于 2 × 104Hz的彈性機械波)可以對種子產(chǎn)生空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)，對種子的細(xì)胞膜進行滲透，加速種子的新陳代謝，促進其萌發(fā)和生長。因其穿透力強、能量大、方向性強，近年來被廣泛用于生物科學(xué)領(lǐng)域的研究[15-20]。有研究表明，超聲波處理能夠縮短大麥(Hordeum vulgare)種子的發(fā)芽時間[21]?？箟难?ascorbic acid,AsA)是植物體內(nèi)的一種抗氧化劑，通過參與植物的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)來清除細(xì)胞中的活性氧[22]，增強植物的抗逆能力[23-24]。外源AsA能夠改善逆境脅迫下種子活力的研究已在甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)[25]和豇豆(Vigna unguiculata)[26]等植物中有所報道。

梭梭(Haloxylon ammodendron)為藜科多年生灌木或小喬木[27]，具有很強的抗旱、抗熱、抗風(fēng)蝕能力，是我國西北部荒漠地區(qū)優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物。貯藏時間過長和貯藏方法不當(dāng)易造成梭梭種子老化，因此采用有效的方法對老化種子進行修復(fù)，對種質(zhì)資源的利用及貯存具有重要意義。目前單獨探討幾種修復(fù)措施對老化種子活力提高的研究較多，而綜合考察兩種修復(fù)手段共同作用的研究甚少。因此，本研究選擇超聲溫度、超聲時間、AsA濃度、AsA作用時間作為因素，采用L9(34)的正交試驗設(shè)計，綜合考慮超聲波和AsA是否可以緩解人工老化對梭梭種子造成的傷害，確定影響因素的主次效應(yīng)并找出最優(yōu)修復(fù)組合，以期提高種子產(chǎn)量和品質(zhì)，加強梭梭種子種質(zhì)資源的貯存效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

試驗中所用的梭梭種子由甘肅廣恒源苗木有限公司提供，收獲于2017年11月，于4 ℃冰箱貯藏至試驗開始，千粒重為3.5 g，發(fā)芽率為95%。

1.1.2 種子含水量測定及含水量的調(diào)整

試驗所用梭梭種子含水量為9.2%，參照國際種籽檢驗協(xié)會 ( International Seed Testing Association,ISTA)規(guī)程第九章的方法[28]，將種子含水量調(diào)整為12%。

1.2 種子老化處理

選取調(diào)整含水量后的健康的種子置于老化盒內(nèi)的支架網(wǎng)上，將老化盒放入老化箱(x型電熱恒溫箱)，接通水源，確保濕度達(dá)到100%。采用預(yù)試驗得出的適宜溫度(41 ℃)和適宜時間(36 h)對種子進行老化處理。

1.3 試驗設(shè)計

試驗選用L9(34)正交表(表1)，將超聲溫度、超聲時間、AsA濃度、AsA時間作為試驗的4個因素，每因素設(shè)3個水平，共9個處理。用超聲儀(KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司，超聲頻率 4 × 104Hz)對老化后的種子進行超聲波處理后用AsA進行浸種，每組3個重復(fù)，對照組不做處理。

表1 超聲波和AsA處理的正交因素與水平組合表L9(34)Table 1 Matrix assigned with factors and levels L9(34) under ultrasound and AsA treatments

將處理后的種子用0.1%的NaClO消毒15 min，無菌水沖洗3遍，取健康飽滿的種子放于鋪有濾紙的15 cm培養(yǎng)皿中，每皿100粒，3個重復(fù)，置于20 ℃，光暗周期 12 h/12 h (光/暗) 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[29]。以胚根出現(xiàn)作為種子發(fā)芽標(biāo)志，每日記錄發(fā)芽數(shù)，持續(xù)到3 d發(fā)芽總數(shù)不變?yōu)橹筟30]，計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)，并測量幼苗長度。

發(fā)芽率=正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%;

發(fā)芽勢=發(fā)芽高峰時正常發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%;

式中：Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為與Dt對應(yīng)的每天發(fā)芽數(shù)。

1.4 指標(biāo)測定

種子浸出液電導(dǎo)率用DDS-307A型電導(dǎo)儀參照徐本美和韓建國[31]的方法測定，電導(dǎo)率 = (浸出液電導(dǎo)率 - 對照空白電導(dǎo)率)/種子質(zhì)量。

生理指標(biāo)的測定在幼苗生長第21天進行。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[32]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT還原法測定[33]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[32]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測定[32]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[34]；脯氨酸含量采用茚三酮法測定[35]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進行數(shù)據(jù)整理和發(fā)芽率、發(fā)芽勢等發(fā)芽指標(biāo)統(tǒng)計作圖，用SPSS 22.0對發(fā)芽指標(biāo)和生理指標(biāo)進行組間差異顯著性分析，結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用 Minitab 17軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 超聲波和AsA對老化梭梭種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

超聲波和AsA處理老化種子后，除了第3、6、9組各項指標(biāo)均顯著低于對照 (CK) 外 (P＜ 0.05)，其他處理組的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和幼苗長度均高于對照，其中第4組(超聲溫度25 ℃，超聲時間 40 min，AsA 濃度 300 mg·L-1，AsA 浸種時間 12 h)效果最好 (圖1)。

圖1 超聲波和AsA處理下老化梭梭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和幼苗長度Figure 1 Effects of ultrasound and AsA treatments on germination rate, germination energy,germination index and seeding length of aged Haloxylon ammodendron seeds

方差分析結(jié)果表明(表2)，因素A(超聲溫度)、B(超聲時間)、C(AsA濃度)、D(AsA時間)均對發(fā)芽指數(shù)有顯著影響(P＜ 0.05)；因素A、B、C均對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和幼苗長度有顯著影響(P＜ 0.05)。極差分析結(jié)果(圖2)表明，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和幼苗長度的極差大小順序均為 A ＞ C ＞ B ＞D，因此4個因素對發(fā)芽結(jié)果的影響程度由大到小表現(xiàn)為 A ＞ C ＞ B ＞ D。

表2 超聲波和AsA對老化梭梭種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和幼苗長度影響的方差分析Table 2 Variance analyses for the models of germination percentage, germination potential, germination index,and seedling length for each of the experimental factors

圖2 老化梭梭種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗長度的正交試驗極差分析Figure 2 Range analyses associated with the orthogonal matrix of germination percentage,germination potential, germination index, and seedling length

2.2 超聲波和AsA處理對老化梭梭種子浸出液電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)的影響

除第3、6、9組外，其他處理組的種子浸出液電導(dǎo)率均顯著低于對照(P＜ 0.05)，第4組效果最好，MDA含量均顯著高于對照(P＜ 0.05)，其中第4組效果最差(表3)。方差分析結(jié)果顯示(表4)，因素A、B、C、D均對種子浸出液電導(dǎo)率有顯著影響(P＜ 0.05)，因素A、C對MDA含量有顯著影響(P＜ 0.05)。極差分析結(jié)果顯示 (圖3)，4個因素對種子浸出液電導(dǎo)率和MDA的影響程度順序均為A ＞ C ＞ B ＞ D。

2.3 超聲波和AsA對老化梭梭種子可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響

除第3、6、9組外，其他處理組的可溶性蛋白含量均高于對照，各組脯氨酸含量均低于對照(表3)。方差分析結(jié)果表明(表4)，因素A、C對可溶性蛋白含量影響顯著(P＜ 0.05)，A、C、D對脯氨酸含量影響顯著 (P＜ 0.05)。極差分析結(jié)果顯示 (圖3)，4個因素對可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響程度由大到小表現(xiàn)為 A ＞ C ＞ B ＞ D。

表3 超聲波和AsA處理下老化梭梭種子的浸出液電導(dǎo)率和丙二醛、可溶性蛋白、脯氨酸含量Table 3 Conductivity, MDA content, soluble protein content, and proline content with ultrasound and AsA treatments in the orthogonal matrix experiment

表4 超聲波和AsA對老化梭梭種子電導(dǎo)率和丙二醛、可溶性蛋白、脯氨酸含量影響的方差分析Table 4 Variance analyses for the models of conductivity, MDA content, soluble protein content,and proline content for each of the experimental factors

圖3 浸出液電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性蛋白和脯氨酸的正交試驗極差分析Figure 3 Range analyses associated with the orthogonal matrix of conductivity, MDA content,soluble protein content, and proline content

2.4 超聲波和AsA處理對老化梭梭種子抗氧化酶活性的影響

除了第3、6、9組外，其他處理組的SOD、POD、CAT活性均顯著提高，3種酶活性均在第4組達(dá)到最大值(表5)。方差分析結(jié)果表明(表6)，因素A、B、C對SOD活性有顯著影響(P＜ 0.05)，因素A、B、C、D對POD和CAT的活性有顯著影響(P＜ 0.05)。極差分析結(jié)果顯示 (圖4)，不同因素對老化梭梭種子SOD和POD的影響程度依次為A ＞C ＞ B ＞ D；對 CAT 的影響程度為 A ＞ B ＞ C ＞ D。

2.5 種子活力及生理指標(biāo)的主成分分析

用SPSS 22.0通過R型主成分分析法對種子活力及各項生理指標(biāo)之間的變化和相互作用進行分析(表7)。可以看出，共得到一個主成分即發(fā)芽率，貢獻(xiàn)率為89.12%，表明發(fā)芽率與老化種子的活力緊密相關(guān)，是研究梭梭種子活力過程中的最具代表性因子，在理論上可以作為代表其他因素的指標(biāo)。

表5 超聲波和AsA處理下老化梭梭種子SOD、POD、CAT活性的正交試驗結(jié)果Table 5 SOD, POD, and CAT activity with ultrasound and AsA treatments in the orthogonal matrix experiment

表6 超聲波和AsA對老化種子SOD、POD、CAT活性影響的方差分析Table 6 Variance analyses for the models of SOD activity, POD activity, and CAT activity for each of the experimental factors

3 討論與結(jié)論

種子在貯藏過程中會不可避免的發(fā)生老化現(xiàn)象，導(dǎo)致活力和品質(zhì)逐漸降低，影響種子正常萌發(fā)和幼苗生長。采用合適的修復(fù)方法可以在一定程度上提高老化種子的活力。本研究中，除了第3、6、9組外，其他處理組的的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和幼苗長度均顯著高于對照，這說明適宜的超聲波和AsA對老化梭梭種子有較明顯的修復(fù)作用，劑量不同修復(fù)效果也不同。類似研究表明，超聲波處理可以提高老化高羊茅(Festuca arundinacea)和新麥草(Psathyrostachys juncea)的發(fā)芽率并促進其生長[15]，適宜濃度的AsA處理也可以提高老化向日葵(Helianthus annuus)種子的發(fā)芽率和芽長[36]。本研究中超聲波和AsA的共同作用下各項發(fā)芽指標(biāo)得到顯著提高，原因可能在于適宜強度的超聲波產(chǎn)生了空化作用，使得細(xì)胞質(zhì)膜透性發(fā)生改變，促進胞內(nèi)和胞外的物質(zhì)的交換和種胚對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[15]，而AsA作為小分子生理活性物質(zhì)，可以激活植物根部分生組織細(xì)胞的分裂，促進種子萌發(fā)和根系的生長[36]。

種子在遭到逆境危害時，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損而導(dǎo)致膜透性增大，電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)。有研究表明，AsA處理可以降低老化茄子(Solanum melongena)種子的浸出液電導(dǎo)率[37]，本研究結(jié)果表明，適宜的超聲波和AsA處理可以顯著降低種子的電導(dǎo)率，可以認(rèn)為修復(fù)處理能緩解老化產(chǎn)生的膜損傷，細(xì)胞膜完整性得到恢復(fù)而使得外滲物減少。

圖4 SOD、POD、CAT活性的正交試驗極差分析Figure 4 Range analyses associated with the orthogonal matrix of SOD, POD and CAT activity

表7 總方差分解表Table 7 Total variance explained

可溶性蛋白作為植物中的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅為種子發(fā)芽和幼苗生長提供氮，其含量還可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和降解情況，因此被作為種子抗逆性的指標(biāo)[2]。本研究中適宜的超聲波和AsA處理后可溶性蛋白含量高于對照，原因可能在于修復(fù)處理抵御或修復(fù)了溶酶體遭到的破壞，避免了可溶性蛋白的降解，還可能因為超聲波和AsA處理后種子的氧化作用減小，也避免了可溶性蛋白的大量消耗[38]。脯氨酸是植物抵御逆境環(huán)境的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，很多研究認(rèn)為，植物體內(nèi)的脯氨酸含量可以作為其抗逆性的參考指標(biāo)，植物在逆境脅迫下會產(chǎn)生一些溶質(zhì)如脯氨酸來進行自我保護，抵抗不良環(huán)境[39-40]。在本研究中各組的脯氨酸含量均低于對照，但規(guī)律性不強，可能是因為修復(fù)作用對脯氨酸影響不大，具體機理有待進一步研究。

衰老過程中種子體內(nèi)的代謝系統(tǒng)發(fā)生紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧和自由基而導(dǎo)致膜脂過氧化損傷。SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)重要的保護酶，可清除過氧化產(chǎn)生的自由基，因此這3種酶活性的變化可以反映植物細(xì)胞的膜脂過氧化情況[41]。對棉花(Gossypium hirsutum)[42]、茄子(Solanum melongena)[43]等老化種子的研究均發(fā)現(xiàn)AsA能顯著增強SOD、POD、CAT的活性。本研究中上述3種酶活均在適宜的超聲波和AsA處理后顯著高于對照，表明修復(fù)處理可以提高抗氧化酶活性，抗氧化酶進一步清除種子體內(nèi)的活性氧和自由基，抵抗老化對種子產(chǎn)生的傷害。這與柳旭等[44]對老化高羊茅的研究結(jié)果類似。MDA作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，經(jīng)過修復(fù)處理后含量相比對照顯著降低，說明修復(fù)處理通過增強抗氧化酶的活性，使得種子體內(nèi)的活性氧得到及時清除而緩解了膜脂過氧化損傷。

超聲波和AsA對老化梭梭種子的處理效果受到超聲溫度、超聲時間、AsA濃度和AsA浸種時間四因素的影響，正交試驗的極差和方差分析表明超聲溫度為影響梭梭種子萌發(fā)各項指標(biāo)的最主要因素，柳旭等[44]在對3種老化牧草種子的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。Liu等[15]研究表明，過高的超聲溫度會破壞質(zhì)膜系統(tǒng)、引起蛋白質(zhì)變性和肽鍵斷裂等，導(dǎo)致種子活力降低甚至死亡。本研究中第3、6、9組各項指標(biāo)異常的原因可能是超聲溫度過高(55 ℃)而對種子產(chǎn)生了致命的傷害。

通過主成分分析得到了發(fā)芽率是研究梭梭種子活力的最具代表性因子，發(fā)芽率的最優(yōu)處理組合即可代表種子的最佳處理組合，極差分析(圖2)表明發(fā)芽率的優(yōu)水平組合為A1B1C2D3，因此本研究中超聲波和AsA對老化梭梭種子的最佳修復(fù)條件超聲溫度 25 ℃，超聲時間 20 min，AsA 濃度 300 mg·L-1，AsA 作用時間 24 h。