張 蕊，姜紅巖，滕 珂，檀鵬輝，汪 呈，劉凌云，常智慧

（1. 北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2. 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097）

為了適應(yīng)不良的生長環(huán)境，植物進化出了復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及許多功能基因，如ERF轉(zhuǎn)錄因子(TFS)等[1-2]。最初分離的乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(EREBPs)，可結(jié)合啟動子GCC box模體，都有一個由59個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域[3]。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和特征，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族可分為3個亞家族，乙烯應(yīng)答因子 (ethylene responsive factor, ERF)屬于超家族中的ERF亞家族，參與植物生長發(fā)育過程以及應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)[4]。目前，AP2/ERF已在不同物種中被認證。擬南芥AtERF108、AtERF111過表達株系在非生物脅迫條件下的過氧化氫和活性氧含量明顯比抑制表達株系和野生型擬南芥低，逆能力明顯提高[5]；小麥(Triticum aestivum)TaERF1/ERF2能夠明顯增強轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)的耐鹽性、抗旱性及抗病性[6]；GmERF8在大豆(Glycine max)根和葉中表達較高，響應(yīng)ABA、高鹽和低溫處理，其表達量呈降低趨勢，乙烯處理和干旱脅迫下則先下降后升高，所以認為GmERF8參與大豆對環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7]。

AP2/ERF TFs作為植物中一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過結(jié)合啟動子的順式作用元件來調(diào)控下游基因的表達[8]。擬南芥AtERF1基因響應(yīng)生物脅迫，結(jié)合到下游基因啟動子GCC元件調(diào)控特定抗性基因表達，增強對病原菌的抵抗能力[9]。菜心(Brassica campestris)BrERF72可通過結(jié)合衰老相關(guān)基因啟動子上的順式元件(GCC和DRE/CRT)來參與JA介導(dǎo)的葉片衰老過程[10]；水稻OsERF1基因調(diào)節(jié)干旱脅迫下ABA響應(yīng)和脯氨酸合成基因表達來增強植物抗旱性[11]；柑橘(Citrus reticulata Blanco)CitERF13轉(zhuǎn)錄因子是PPH基因的激活子，加速果皮葉綠素降解，有助于柑橘果實品質(zhì)的形成[12]，且CitERF13可能通過多種途徑參與光合作用的調(diào)節(jié)[13]。

日本結(jié)縷草(Zoysia japonica)作為一種牧草和草坪草在我國被廣泛使用，因其優(yōu)良的特性成為研究植物抗性分子機制最有價值的材料[14]。盡管關(guān)于ERF在不同物種中已有大量研究，但是在多年生草本植物中的研究甚少。本研究旨在對克隆得到的一個ZjERF2基因，進行亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄激活特性驗證以及不同處理下的表達情況分析，為深入研究該基因在植物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料及處理

日本結(jié)縷草種子由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所劉建秀研究員提供，所選品種為“Meyer”。栽培于 12 cm × 12 cm 的花盆，營養(yǎng)基質(zhì)為蛭石、草炭、珍珠巖1∶1∶1體積的混合基質(zhì)，生長于人工氣候培養(yǎng)箱；本生煙草種子由北京林業(yè)大學(xué)實驗室保存，培養(yǎng)條件與日本結(jié)縷草相同。選取健康生長的日本結(jié)縷草剪取根、莖、葉，同時剪取幼嫩、成熟和衰老時期葉片；選取5盆長勢相同的日本結(jié)縷草分別噴施 10 μmol·L-1脫落酸、10 μmol·L-1茉莉酸甲酯、200 μmol·L-1乙烯，澆灌 300 mmol·L-1NaCl和20% PEG6000溶液。分別在處理后的0、1、3、6、12 和24 h取葉片樣品并迅速置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱備用。每種處理取3個生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 主要試劑及儀器

農(nóng)桿菌EHA105、亞細胞定位載體3302Y3、酵母pGBKT7載體、Y2H Gold酵母菌株均由北京林業(yè)大學(xué)實驗室保存；RACE試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BglⅡ、BamHⅠ、克隆載體pMD-19T、Prime STAR HS DNA Polymerase、無縫連接酶、-Trp和-Trp-His-Ade培養(yǎng)基等購于寶生物公司；RNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購于天根生化科技公司；PCR Mix、SYBR Mix購自康為世紀(jì)公司；氯化鈉(NaCL)，聚乙二醇(PEG6000)、乙烯利(ET)、脫落酸(ABA)和茉莉酸甲脂(MeJA)購于SIGMA-ALDRICH。本研究所用的熒光定量儀為BIO-RADCFX Connect，激光共聚焦顯微鏡為LEICA SP-5。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)之前的日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計5’/3’RACE的引物，根據(jù)DNAMAN 8.0拼接測序結(jié)果，設(shè)計引物ZjERF2-F/R擴增ORF。根據(jù)ZjERF2基因gDNA序列的5’端設(shè)計染色體步移3條特異性引物SP1、SP2、SP3。根據(jù)染色體步移測序結(jié)果設(shè)計引物ZjERF2-Pro-F/R擴增啟動子序列。亞細胞定位載體構(gòu)建引物3302Y3-ERF2-F/R，pGBKT7載體構(gòu)建所需引物BD-ERF2-F/R。設(shè)計熒光定量引物qPCR-F/R及熒光定量內(nèi)參引物ACT-F/R(表1)。

1.2.2 基因克隆與生物信息學(xué)分析

用試劑盒提取健康生長的日本結(jié)縷草總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以5’/3’RACE為引物，按照RACE試劑盒說明書進行5’/3’RACE，以cDNA為模板、ZjERF2-F/R為引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物純化后連接克隆載體pMD-19T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取大小均一的菌落進行PCR反應(yīng)，凝膠電泳出現(xiàn)單一條帶的菌液送往公司進行測序，從測序正確的菌液中提取質(zhì)粒用于后續(xù)試驗。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

通過DNA MAN7.0軟件將ZjERF2基因的核酸序列翻譯為氨基酸序列。通過NCBI網(wǎng)站Blast功能進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析和不同物種同源比對；利用 http://web.expasy.org/protparam/及 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/對ZjERF2編碼蛋白的一、二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；通過SignalP4.1 Server網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測該蛋白是否帶有信號肽。通過MEGA5.0軟件中Neigh-bor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在 Cell-PLoc 2.0 package 網(wǎng)站 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對亞細胞定位情況進行預(yù)測。

1.2.3 啟動子克隆與作用元件預(yù)測

CTAB法提取日本結(jié)縷草葉片DNA，以日本結(jié)縷草gDNA為模板，以SP1、SP2、SP3為引物進行PCR反應(yīng)，第1(2)步PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍作為第2(3)步PCR模板，將1、2、3輪PCR產(chǎn)物分別取5 μL進行電泳，第3步PCR產(chǎn)物進行DNA測序。以日本結(jié)縷草gDNA為模板、ZjERF2-Pro-F/R為引物擴增啟動子序列，將PCR產(chǎn)物純化后連接克隆載體pMD-19T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)涂板、挑菌、菌液PCR，檢測為陽性的菌液送公司測序。將啟動子序列導(dǎo)入PLACE網(wǎng)站(https://sogo.dna.affrc.go.jp)，分析該啟動子上存在的作用元件。

1.2.4 構(gòu)建載體

以構(gòu)建的pMD-ZjERF2質(zhì)粒為模板，3302YERF2-F/R為引物進行PCR擴增，PCR純化產(chǎn)物與BglⅡ單酶切過的3302Y3載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，檢測為陽性的菌液送公司測序，測序正確的菌液即為所構(gòu)建的 35S:ZjERF2:YFP 載體；pMDZjERF2質(zhì)粒為模板、BD-ERF2-F/R為引物進行PCR擴增，然后利用BamHⅠ單酶切pGBKT7載體，將PCR產(chǎn)物及載體單酶切產(chǎn)物進行純化，之后在無縫連接酶的作用下進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆送公司測序，測序正確的菌液提取質(zhì)粒，保菌備用。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄激活活性驗證

利用LiAC方法[15]將pGBKT7-ZjERF2轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，100～200 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基上，同時轉(zhuǎn)化pGBKT7空載體為對照。挑取成功轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒的酵母單克隆，30 ℃搖培48 h后稀釋10倍、100倍，取10 μL原液及稀釋后的菌液分別點樣于SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基，倒置，30 ℃培養(yǎng)3 d左右直至出現(xiàn)菌落，利用 Cannon EOS 60D 拍照。

1.2.6 亞細胞定位

采用凍融法將構(gòu)建好的 35S:ZjERF2:YFP 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含50 mg·L-1Kana 和 50 mg·L-1Rif的 LB 培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng) 2 d，挑取大小均一、白色透明的菌落進行菌液PCR，有條帶的菌液進行DNA測序，比對正確即表明載體成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。使用注射器將成功轉(zhuǎn)化目的基因的農(nóng)桿菌菌液打入本生煙草葉片，同時注射轉(zhuǎn)化3302Y3空載體的菌液作為對照，黑暗培養(yǎng)48 h后在激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-5)下觀察葉片細胞中熒光的分布。

1.2.7 表達分析

采用Trizol法提取植株總RNA，取6 μL反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，qPCR-F/R為引物、Actin基因(GenBank登錄號：GU290546)為內(nèi)參qRTPCR檢測ZjERF2基因在不同條件下的表達量。每個樣品包括3個生物學(xué)重復(fù)及4個技術(shù)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量[16]，利用Excel 2010作圖，SPSS18.0進行單因素方差分析和LSD法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZjERF2基因的克隆和生物信息學(xué)分析

從日本結(jié)縷草中克隆得到ZjERF2基因，開放閱讀框為825 bp，編碼274個氨基酸(圖1)。在NCBI網(wǎng)站進行Blast分析，發(fā)現(xiàn)ZjERF2編碼蛋白含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，具有ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員的特性；CLUSTALW的多序列比對結(jié)果顯示，ZjERF2與黍 (Panicum hallii)、谷子 (Setaria italica)同源蛋白的相似性達到80%(圖2A)。在線預(yù)測的該蛋白一級結(jié)構(gòu)有以下特征，分子量為26.05 kDa、理論等電點為6.23，其中陰性氨基酸(Asp+Glu)31個、陽性氨基酸(Arg+Lys)29個，總平均親水性-0.46，屬于親水蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，ZjERF2不含信號肽。構(gòu)建好的系統(tǒng)進化樹中ZjERF2與谷子(GenBank登錄號為XP_004954129)的親緣關(guān)系最近(圖2B)。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，ZjERF2定位于細胞核。

圖1 ZjERF2基因及啟動子的克隆Figure 1 Cloning of ZjERF2 gene and its promoter

2.2 ZjERF2啟動子的克隆和作用元件分析

通過染色體步移獲得ZjERF2基因ATG上游1 549 bp的啟動子序列(圖1)。啟動子在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ZjERF2啟動子包含常見的順式作用元件CAAT-box、TATA-box和大量光感應(yīng)元件，此外還有赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、熱脅迫相應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、與MYB結(jié)合的干旱響應(yīng)元件以及與分生組織發(fā)育相關(guān)元件(圖3)。

2.3 ZjERF2轉(zhuǎn)錄激活活性分析

10 μL原液及稀釋10倍、100倍后的稀釋菌液點樣在-Trp和-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d后酵母生長情況如圖4所示，在-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上，空載pGBKT7在3種濃度梯度下，都沒有有生長跡象，而重組載體pGBKT7-ZjERF2都可以正常生長。本研究表明：ZjERF2能夠激活組氨酸合成基因的表達，具有較強的自激活活性。

2.4 ZjERF2編碼蛋白亞細胞定位

將成功轉(zhuǎn)化 35S:ZjERF2:YFP 和 35S:YFP 的農(nóng)桿菌菌液分別轉(zhuǎn)入本生煙草，在黑暗條件下培養(yǎng)48 h后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)在激發(fā)場和融合場下，轉(zhuǎn)35S:YFP的熒光信號分布于整個細胞中，而 35S:ZjERF2:YFP 定位于葉細胞核(圖5)。亞細胞定位結(jié)果表明，ZjERF2定位于細胞核。

2.5 ZjERF2表達模式分析

2.5.1ZjERF2在不同組織中的表達

剪取正常生長的日本結(jié)縷草成熟植株的根、莖、葉樣品，分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行熒光定量分析，結(jié)果顯示，ZjERF2在不同組織中的表達有顯著差異，葉中的表達量要顯著高于根和莖中(P＜ 0.05)，分別是根中的2.61倍，莖中的1.57 倍 (圖6A)。

2.5.2ZjERF2在不同發(fā)育時期的表達

分別剪取幼嫩葉片、成熟葉片、衰老葉片做熒光定量分析，結(jié)果表明，ZjERF2在葉片不同發(fā)育時期存在差異，成熟葉片中的表達量顯著高于衰老期和幼苗期(P＜ 0.05)，表達量最高達到4.21，衰老期的表達量相對于幼苗期也差異顯著(P＜ 0.05)(圖6B)。

2.5.3ZjERF2在不同激素和脅迫處理下的表達

ET、MeJA兩種激素處理后，對日本結(jié)縷草中ZjERF2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)ET處理誘導(dǎo)ZjERF2基因的表達，處理前3 h表達量下降，在6 h又迅速升高，達到最高水平6.70，顯著高于其他時間(P＜ 0.05)，為初始水平的1.30倍，12 h 和 24 h 的表達量呈下降趨勢 (圖6C)。MeJA 處理ZjERF2基因表達變化與ET基本一致，在處理后 6 h 達到峰值，是 0 h 的 2.56 倍 (P＜ 0.05)，24 h顯著低于初始水平(圖6D)。

ABA、PEG、NaCl處理后 24 h內(nèi)ZjERF2基因的表達均受到抑制，其中PEG抑制作用最為明顯，表達水平在24 h內(nèi)一直處于抑制狀態(tài)，6 h時比起始水平下降了40倍左右，ABA處理ZjERF2基因表達則先下降后又有小幅度的回升，ABA和NaCl處理均不高于起始水平(圖6 E、F、G)。

圖2 ZjERF2基因的同源性比對和遺傳進化分析Figure 2 Multiple sequences alignment and genetic evolution analysis of ZjERF2 gene

3 討論

圖3 啟動子作用元件分布Figure 3 Distribution of promoter cis-element

圖4 ZjERF2轉(zhuǎn)錄激活活性驗證Figure 4 Validation of ZjERF2 transcriptional activation activity

圖5 ZjERF2的亞細胞定位Figure 5 Subcellular localization of ZjERF2

日本結(jié)縷草作為一種廣泛利用的草坪草，其對不良環(huán)境的適應(yīng)能力直接關(guān)系到草坪的品質(zhì)[17]。AP2/ERF TFs是同植物抗逆應(yīng)答密切相關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子大家族，它們與順式作用元件或其他蛋白特異性結(jié)合的親和力使它們能夠同時響應(yīng)不同的調(diào)控過程[18]。本研究從日本結(jié)縷草內(nèi)克隆得到ZjERF2基因。對ZjERF2基因編碼的蛋白序列進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明其與谷子、黍的同源物序列相似性較高，含有一個AP2蛋白保守結(jié)構(gòu)域，屬于ERF亞家族；N端不含信號肽，說明該蛋白翻譯后水平不需要進行加工和切除可直接發(fā)揮功能。亞細胞定位結(jié)果顯示該蛋白分布在細胞核中，與丹參(Salvia miltiorrhiza)SmERF1[19]、青蒿(Artemisia annua)AaORA[20]、楊樹(Populus)ERF76[21]等的定位情況一致。酵母自激活分析證明日本結(jié)縷草ZjERF2具有轉(zhuǎn)錄激活活性，與水稻(Oryza sativa)核定位蛋白OsEFF71的結(jié)果一致[11]。亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄激活分析結(jié)果表明：ZjERF2具有典型的轉(zhuǎn)錄因子特性。

圖6 ZjERF2在不同組織中、不同發(fā)育時期及不同激素和脅迫處理下的表達特征分析Figure 6 Analysis of ZjERF2 expression characteristics in varied tissues, and at different developmental stages,and under hermone and stress treatments

熒光定量結(jié)果表明，ZjERF2在日本結(jié)縷草根、莖、葉中均有表達，但不同組織中存在顯著差異，葉中表達量明顯高于根和莖。這與甜瓜(Cucumis melo)CmERFIV-5、茶樹 (Camellia sinensis)ERF基因在根、莖、葉中的表達情況一致[22-23]。不同發(fā)育時期熒光定量結(jié)果顯示，隨著植物成熟，葉片ZjERF2基因表達量升高，在植物衰老期又有所下降但高于幼苗期，表明該基因可能參與調(diào)控植物成熟及衰老進程。這與果實中ERF基因促進果實成熟機理一致，如西紅柿(Lycopersicon esculentum)SIAP2a[24]、甜瓜CMeERF1/2[25]、柑橘CitERF13[19]等。

乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與多種發(fā)育過程和應(yīng)激反應(yīng)，AP2/ERF對這些信號級聯(lián)反應(yīng)高度敏感[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施ET和MeJA都可以誘導(dǎo)ZjERF2基因表達。前人研究也有相同結(jié)果，如擬南芥AtERF1/4[27-28]、谷子(Setaria italica)SiERF[29]和煙草Tsi1基因等[30]。研究發(fā)現(xiàn)ERFs基因不僅受乙烯誘導(dǎo)，還受多種非生物脅迫的誘導(dǎo)。本研究用NaCl和PEG6000處理后，日本結(jié)縷草ZjERF2基因處于抑制表達狀態(tài)，這與小麥ERF1/2[31]、大豆GmERF[32]、青楊[33]受鹽和干旱強烈誘導(dǎo)的結(jié)果不同。原因可能是日本結(jié)縷草中ZjERF2基因在SA、JA、ET等參與的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要作用，而不參與干旱、鹽等滲透脅迫應(yīng)答；或者非生物應(yīng)答途徑獨立于乙烯信號途徑。具體原因有待于進一步試驗論證。許多AP2/ERF響應(yīng)ABA信號，本研究ABA處理對ZjERF2基因有明顯的抑制作用，這與擬南芥AtERF1/4[9]、 丹參SmERF1[19]和矮牽牛(Petunia hybrida)PhERF9/10/12/1[34]結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究從日本結(jié)縷草中克隆了ZjERF2基因，其開放閱讀框為825 bp，編碼274個氨基酸。同時，得到ZjERF2基因上游1 549 bp的啟動子序列，該序列含有多個與生長發(fā)育相關(guān)和響應(yīng)非生物脅迫的作用元件。亞細胞定位結(jié)果顯示，ZjERF2定位于細胞核，說明該蛋白在細胞核發(fā)揮功能；轉(zhuǎn)錄激活分析表明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。熒光定量數(shù)據(jù)表明，ZjERF2在成熟葉片中高表達，且ZjERF2的表達受ET、MeJA、ABA及鹽和干旱處理的調(diào)節(jié)。本研究為進一步探索ZjERF2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。