賈光輝 郭 民

內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市中心醫(yī)院普外科，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000

結(jié)直腸癌（CRC）在全世界范圍內(nèi)均有較高的發(fā)病率，位居全省惡性腫瘤第3 位，近些年受多種因素影響我國(guó)疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，早期有效篩查、診斷疾病對(duì)改善患者預(yù)后、提高患者生存率有重要意義[1]。RUNX3 基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其通過(guò)參與TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞分化、惡變、凋亡等過(guò)程[2]。有研究指出RUNX3 基因表達(dá)下調(diào)與基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化有關(guān)，而RUNX3基因表達(dá)下降，會(huì)導(dǎo)致TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)抑制，造成細(xì)胞凋亡失控，從而促腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，其可能成為臨床腫瘤預(yù)后評(píng)估重要指標(biāo)[3]。本研究通過(guò)觀察結(jié)直腸癌組織、正常黏膜組織RUNX3 甲基化狀態(tài)，分析基因甲基化與疾病預(yù)后的關(guān)系，旨在為今后疾病早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年5月～2013年11月病理確診為原發(fā)性CRC 患者59 例為研究對(duì)象，所有患者均行根治性切除治療，醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者病歷資料完整，未合并其他惡性腫瘤，未行放化療，簽署知情同意書(shū)。獲取患者癌組織、正常黏膜組織（距腫瘤邊緣10cm 以上），標(biāo)本取出后即刻液氮冷卻?；颊吣挲g31～69 歲，平均（47.2±5.3）歲，腫瘤直徑3.5～7.8cm，平均（5.0±1.3）cm，位置：直腸35 例、結(jié)腸24 例。

表1 不同組織RUNX3蛋白表達(dá)、甲基化狀態(tài)[n（%）]

1.2 試劑、儀器

試劑、儀器：DAB 顯色試劑盒、鼠抗人RUNX3單克隆抗體（美國(guó)Sigma 公司）、免疫組化SP 試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）、DNA 提取試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司）、甲基化酶（美國(guó)New England Biolabs 公司）、甲基化試劑盒（美國(guó)Zymo Research 公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法 在獲取觀察標(biāo)本組織后固定（10%甲醛溶液），石蠟包埋、切片（厚度5μm），烘片、脫蠟、脫水，加3%過(guò)氧化氫，行抗原高壓熱修復(fù)，加封閉液（山羊血清）室溫封閉30min，后加一抗孵育1h（放于濕盒內(nèi)，在37℃環(huán)境下），以PBS沖洗（3 次，5min/次），加二抗覆蓋組織后室溫孵育（30min），PBS 沖洗，加DAB 顯色，蘇木精復(fù)染、1%鹽酸乙醇分化，脫水、透明、樹(shù)膠封片。

1.3.2 MSP 檢測(cè) 以DNA 提取試劑盒提取標(biāo)本組織中DNA，后以甲基化試劑盒對(duì)DAN 進(jìn)行修飾，后構(gòu)建反應(yīng)體系（0.5μL cDNA、2.5μL PCR Buffer、1μL 上 下 引 物、2μL dNTP、0.2TapE、16.3μL dd H2O）行定量PCR 擴(kuò)增，條件：94℃ 5min（預(yù)變性）、94℃ 30s（變性）、65.6℃（M 甲基化反應(yīng)）或61.2℃（U非甲基化反應(yīng)）30s（退火）、72℃ 55s（延伸）共35個(gè)循環(huán)。后以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，自動(dòng)成像儀照相分析。

引物M，上游：5’TTACGAGGGGCGGTGGTACGCGGG3’，下游：5’AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度220。

引物U，上游：5’TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG3’，下游：5’AAAACAACCAACACAAACACCTCC3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度234。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察不同組織中RUNX3 蛋白表達(dá)及甲基化狀態(tài)，所有患者隨訪5年，分析基因甲基化與疾病預(yù)后的關(guān)系。本次甲基化狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：陽(yáng)性，僅出現(xiàn)甲基化本條帶或同時(shí)出現(xiàn)甲基化、非甲基化條帶；陰性，僅出現(xiàn)非甲基化條帶。RUNX3 蛋白表達(dá)以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與顯色強(qiáng)度乘積評(píng)分進(jìn)行評(píng)估[5]：陽(yáng)性，乘積評(píng)分2 分以上，陰性，兩者乘積1 分以下；顯色強(qiáng)度：無(wú)色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0 分為陽(yáng)性細(xì)胞率10%以下，11%～29% 計(jì)1 分，2 分 為30%～49%，50%以上為3 分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果采用SPSS19.0 系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織RUNX3蛋白表達(dá)、甲基化狀態(tài)

癌組織中RUNX3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為49.15%低于正常組織94.92%，同時(shí)RUNX3 甲基化陽(yáng)性40.68%高于正常組織0，P＜0.05。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 RUNX3 蛋白甲基化狀態(tài)（Ma 為標(biāo)記，N 為正常組織，T 為腫瘤）

2.2 RUNX3甲基化狀態(tài)與CRC預(yù)后關(guān)系

患者隨訪5年，其中24 例死亡、34 例存活、1例失訪，中位生存時(shí)間51 個(gè)月，對(duì)影響患者存活的臨床病理因素進(jìn)行分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RUNX3 甲基化狀態(tài)與患者存活有關(guān)，P＜0.05，與年齡、分期、分化程度無(wú)關(guān)，P＞0.05。見(jiàn)表2、圖2。

3 討論

腫瘤形成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及基因異常表達(dá)、飲食等多方面，臨床認(rèn)為表觀遺傳學(xué)、基因序列改變是造成腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，其中表觀遺傳學(xué)改變多依靠改變基因甲基化狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)。有研究表明人體中抑癌基因的異常甲基化會(huì)抑制癌細(xì)胞凋亡，起到促腫瘤發(fā)生，致惡性表型的作用，因此有學(xué)者提出通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者抑癌基因甲基化狀態(tài)，從而來(lái)判斷癌細(xì)胞侵潤(rùn)程度、患者預(yù)后情況[6-7]。

表2 患者存活的臨床病理單因素分析

圖2 CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲線

RUNX3 是近些年臨床發(fā)現(xiàn)的新型基因，位于染色體lp36.1，全長(zhǎng)67kb，其中啟動(dòng)子p2 可控制基因轉(zhuǎn)錄，有研究表明RUNX3 蛋白可通過(guò)指導(dǎo)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，激活Smad 蛋白復(fù)合物，使復(fù)合物轉(zhuǎn)入特定核內(nèi)靶點(diǎn)位，從而激活相關(guān)靶基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控、惡性轉(zhuǎn)變、分化等過(guò)程[8-9]。以往已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)RUNX3 基因甲基化與胃癌發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后相關(guān)，此基因甲基化除了在胃癌前病變、早期腺癌形成中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在肺癌、膀胱癌發(fā)病中起重要作用[10-11]。但目前有關(guān)RUNX3 基因甲基與結(jié)直腸癌發(fā)生、預(yù)后關(guān)系的研究較少，故本文對(duì)此進(jìn)行探究分析。本次對(duì)CRC 者癌組織、正常組織中RUNX3 蛋白表達(dá)及基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)癌組織中RUNX3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為49.15%低于正常組織94.92%，同時(shí)RUNX3 基因甲基化陽(yáng)性40.68%高于正常組織0，P＜0.05，提示CRC 發(fā)生可能與RUNX3 異常表達(dá)有關(guān)，RUNX3 基因甲基化有腫瘤特異性，基因高甲基化可能與CRC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本次研究中RUNX3 蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，而基因甲基化狀態(tài)表現(xiàn)為升高，提示基因甲基化可能通過(guò)阻礙轉(zhuǎn)錄因子、DNA 之間相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄降低RUNX3 蛋白表達(dá)，致Smad蛋白功能受限，從而使細(xì)胞對(duì)正常分化過(guò)程的調(diào)節(jié)失控，癌細(xì)胞擺脫TGF-β 作用，進(jìn)而促癌發(fā)生、發(fā)展[12-13]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清CRC 甲基化者復(fù)發(fā)率高于CRC 非甲基化者，RUNX3 甲基化與CRC 腫瘤分期、淋巴結(jié)侵潤(rùn)有關(guān)，其認(rèn)為血清RUNX3 基因甲基化可能成為疾病早期診斷、治療預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[14]。本研究觀察RUNX3 甲基化狀態(tài)與CRC預(yù)后關(guān)系，對(duì)患者隨訪5年，5年存活率為57.62%（34/59），繪制CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲線，發(fā)現(xiàn)非甲基化患者累積存活率高于甲基化患者。同時(shí)通過(guò)對(duì)影響患者存活的臨床病理因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RUNX3 甲基化狀態(tài)與患者存活有關(guān)，P＜0.05，與年齡、分期、分化程度無(wú)關(guān)，P＞0.05。結(jié)果提示RUNX3 甲基化狀態(tài)可作為臨床判斷CRC 患者預(yù)后的生物指標(biāo)，但由于本次研究樣本量較小，且正常黏膜組織取自CRC 患者，無(wú)法排出正常人的黏膜組織中RUNX3 表達(dá)情況，所得結(jié)論存在誤差，仍有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究、證實(shí)結(jié)論[15]。

綜上所述，RUNX3 蛋白表達(dá)、基因甲基化狀態(tài)在CRC 癌組織、正常組織中存在差異，RUNX3 基因甲基化狀態(tài)可能為疾病發(fā)生、預(yù)后判斷提供依據(jù)。