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        RUNX3基因甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)生中作用及與預(yù)后的關(guān)系研究

        2019-06-04 03:04:44賈光輝
        中國(guó)醫(yī)藥科學(xué) 2019年9期

        賈光輝 郭 民

        內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市中心醫(yī)院普外科,內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000

        結(jié)直腸癌(CRC)在全世界范圍內(nèi)均有較高的發(fā)病率,位居全省惡性腫瘤第3 位,近些年受多種因素影響我國(guó)疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì),早期有效篩查、診斷疾病對(duì)改善患者預(yù)后、提高患者生存率有重要意義[1]。RUNX3 基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,其通過(guò)參與TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞分化、惡變、凋亡等過(guò)程[2]。有研究指出RUNX3 基因表達(dá)下調(diào)與基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化有關(guān),而RUNX3基因表達(dá)下降,會(huì)導(dǎo)致TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)抑制,造成細(xì)胞凋亡失控,從而促腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移,其可能成為臨床腫瘤預(yù)后評(píng)估重要指標(biāo)[3]。本研究通過(guò)觀察結(jié)直腸癌組織、正常黏膜組織RUNX3 甲基化狀態(tài),分析基因甲基化與疾病預(yù)后的關(guān)系,旨在為今后疾病早期診斷提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選擇2012年5月~2013年11月病理確診為原發(fā)性CRC 患者59 例為研究對(duì)象,所有患者均行根治性切除治療,醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò),患者病歷資料完整,未合并其他惡性腫瘤,未行放化療,簽署知情同意書(shū)。獲取患者癌組織、正常黏膜組織(距腫瘤邊緣10cm 以上),標(biāo)本取出后即刻液氮冷卻?;颊吣挲g31~69 歲,平均(47.2±5.3)歲,腫瘤直徑3.5~7.8cm,平均(5.0±1.3)cm,位置:直腸35 例、結(jié)腸24 例。

        表1 不同組織RUNX3蛋白表達(dá)、甲基化狀態(tài)[n(%)]

        1.2 試劑、儀器

        試劑、儀器:DAB 顯色試劑盒、鼠抗人RUNX3單克隆抗體(美國(guó)Sigma 公司)、免疫組化SP 試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)、DNA 提取試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司)、甲基化酶(美國(guó)New England Biolabs 公司)、甲基化試劑盒(美國(guó)Zymo Research 公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 免疫組化法 在獲取觀察標(biāo)本組織后固定(10%甲醛溶液),石蠟包埋、切片(厚度5μm),烘片、脫蠟、脫水,加3%過(guò)氧化氫,行抗原高壓熱修復(fù),加封閉液(山羊血清)室溫封閉30min,后加一抗孵育1h(放于濕盒內(nèi),在37℃環(huán)境下),以PBS沖洗(3 次,5min/次),加二抗覆蓋組織后室溫孵育(30min),PBS 沖洗,加DAB 顯色,蘇木精復(fù)染、1%鹽酸乙醇分化,脫水、透明、樹(shù)膠封片。

        1.3.2 MSP 檢測(cè) 以DNA 提取試劑盒提取標(biāo)本組織中DNA,后以甲基化試劑盒對(duì)DAN 進(jìn)行修飾,后構(gòu)建反應(yīng)體系(0.5μL cDNA、2.5μL PCR Buffer、1μL 上 下 引 物、2μL dNTP、0.2TapE、16.3μL dd H2O)行定量PCR 擴(kuò)增,條件:94℃ 5min(預(yù)變性)、94℃ 30s(變性)、65.6℃(M 甲基化反應(yīng))或61.2℃(U非甲基化反應(yīng))30s(退火)、72℃ 55s(延伸)共35個(gè)循環(huán)。后以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),自動(dòng)成像儀照相分析。

        引物M,上游:5’TTACGAGGGGCGGTGGTACGCGGG3’,下游:5’AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度220。

        引物U,上游:5’TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG3’,下游:5’AAAACAACCAACACAAACACCTCC3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度234。

        1.4 觀察指標(biāo)

        觀察不同組織中RUNX3 蛋白表達(dá)及甲基化狀態(tài),所有患者隨訪5年,分析基因甲基化與疾病預(yù)后的關(guān)系。本次甲基化狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]:陽(yáng)性,僅出現(xiàn)甲基化本條帶或同時(shí)出現(xiàn)甲基化、非甲基化條帶;陰性,僅出現(xiàn)非甲基化條帶。RUNX3 蛋白表達(dá)以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與顯色強(qiáng)度乘積評(píng)分進(jìn)行評(píng)估[5]:陽(yáng)性,乘積評(píng)分2 分以上,陰性,兩者乘積1 分以下;顯色強(qiáng)度:無(wú)色0 分,淺黃色1 分,棕黃色2 分,棕褐色3 分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):0 分為陽(yáng)性細(xì)胞率10%以下,11%~29% 計(jì)1 分,2 分 為30%~49%,50%以上為3 分。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        本次數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果采用SPSS19.0 系統(tǒng)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以()表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同組織RUNX3蛋白表達(dá)、甲基化狀態(tài)

        癌組織中RUNX3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為49.15%低于正常組織94.92%,同時(shí)RUNX3 甲基化陽(yáng)性40.68%高于正常組織0,P<0.05。見(jiàn)表1、圖1。

        圖1 RUNX3 蛋白甲基化狀態(tài)(Ma 為標(biāo)記,N 為正常組織,T 為腫瘤)

        2.2 RUNX3甲基化狀態(tài)與CRC預(yù)后關(guān)系

        患者隨訪5年,其中24 例死亡、34 例存活、1例失訪,中位生存時(shí)間51 個(gè)月,對(duì)影響患者存活的臨床病理因素進(jìn)行分析,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RUNX3 甲基化狀態(tài)與患者存活有關(guān),P<0.05,與年齡、分期、分化程度無(wú)關(guān),P>0.05。見(jiàn)表2、圖2。

        3 討論

        腫瘤形成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程,涉及基因異常表達(dá)、飲食等多方面,臨床認(rèn)為表觀遺傳學(xué)、基因序列改變是造成腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因,其中表觀遺傳學(xué)改變多依靠改變基因甲基化狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)。有研究表明人體中抑癌基因的異常甲基化會(huì)抑制癌細(xì)胞凋亡,起到促腫瘤發(fā)生,致惡性表型的作用,因此有學(xué)者提出通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者抑癌基因甲基化狀態(tài),從而來(lái)判斷癌細(xì)胞侵潤(rùn)程度、患者預(yù)后情況[6-7]。

        表2 患者存活的臨床病理單因素分析

        圖2 CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲線

        RUNX3 是近些年臨床發(fā)現(xiàn)的新型基因,位于染色體lp36.1,全長(zhǎng)67kb,其中啟動(dòng)子p2 可控制基因轉(zhuǎn)錄,有研究表明RUNX3 蛋白可通過(guò)指導(dǎo)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo),激活Smad 蛋白復(fù)合物,使復(fù)合物轉(zhuǎn)入特定核內(nèi)靶點(diǎn)位,從而激活相關(guān)靶基因,參與細(xì)胞周期調(diào)控、惡性轉(zhuǎn)變、分化等過(guò)程[8-9]。以往已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)RUNX3 基因甲基化與胃癌發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后相關(guān),此基因甲基化除了在胃癌前病變、早期腺癌形成中發(fā)揮重要作用,同時(shí)在肺癌、膀胱癌發(fā)病中起重要作用[10-11]。但目前有關(guān)RUNX3 基因甲基與結(jié)直腸癌發(fā)生、預(yù)后關(guān)系的研究較少,故本文對(duì)此進(jìn)行探究分析。本次對(duì)CRC 者癌組織、正常組織中RUNX3 蛋白表達(dá)及基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)癌組織中RUNX3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為49.15%低于正常組織94.92%,同時(shí)RUNX3 基因甲基化陽(yáng)性40.68%高于正常組織0,P<0.05,提示CRC 發(fā)生可能與RUNX3 異常表達(dá)有關(guān),RUNX3 基因甲基化有腫瘤特異性,基因高甲基化可能與CRC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本次研究中RUNX3 蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì),而基因甲基化狀態(tài)表現(xiàn)為升高,提示基因甲基化可能通過(guò)阻礙轉(zhuǎn)錄因子、DNA 之間相互作用,抑制轉(zhuǎn)錄降低RUNX3 蛋白表達(dá),致Smad蛋白功能受限,從而使細(xì)胞對(duì)正常分化過(guò)程的調(diào)節(jié)失控,癌細(xì)胞擺脫TGF-β 作用,進(jìn)而促癌發(fā)生、發(fā)展[12-13]。

        有學(xué)者發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清CRC 甲基化者復(fù)發(fā)率高于CRC 非甲基化者,RUNX3 甲基化與CRC 腫瘤分期、淋巴結(jié)侵潤(rùn)有關(guān),其認(rèn)為血清RUNX3 基因甲基化可能成為疾病早期診斷、治療預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[14]。本研究觀察RUNX3 甲基化狀態(tài)與CRC預(yù)后關(guān)系,對(duì)患者隨訪5年,5年存活率為57.62%(34/59),繪制CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲線,發(fā)現(xiàn)非甲基化患者累積存活率高于甲基化患者。同時(shí)通過(guò)對(duì)影響患者存活的臨床病理因素進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RUNX3 甲基化狀態(tài)與患者存活有關(guān),P<0.05,與年齡、分期、分化程度無(wú)關(guān),P>0.05。結(jié)果提示RUNX3 甲基化狀態(tài)可作為臨床判斷CRC 患者預(yù)后的生物指標(biāo),但由于本次研究樣本量較小,且正常黏膜組織取自CRC 患者,無(wú)法排出正常人的黏膜組織中RUNX3 表達(dá)情況,所得結(jié)論存在誤差,仍有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究、證實(shí)結(jié)論[15]。

        綜上所述,RUNX3 蛋白表達(dá)、基因甲基化狀態(tài)在CRC 癌組織、正常組織中存在差異,RUNX3 基因甲基化狀態(tài)可能為疾病發(fā)生、預(yù)后判斷提供依據(jù)。

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