杜朝東 朱 松 于 添 叢 欣 陳尚衛(wèi)

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.恩施德源健康科技發(fā)展有限公司，湖北 恩施 445000)

硒作為人體必需的微量元素，具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]等生物活性。有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，硒作為體內(nèi)抗氧化蛋白的重要組成部分，在清除活性氧、抑制自由基對細(xì)胞的損害等方面起著重要的作用?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)體內(nèi)硒的含量來調(diào)節(jié)體內(nèi)硒蛋白的活性。雷紅靈等[6]發(fā)現(xiàn)碎米薺硒蛋白在小鼠體內(nèi)能夠明顯地提高體內(nèi)硒酶含量，降低丙二醛含量，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

堇葉碎米薺作為一種十字花科超富硒植物，其硒含量高達(dá)1 414 mg/kg，遠(yuǎn)高于富硒酵母[7]、富硒小麥[8]、富硒大豆[9]等。堇葉碎米薺幼嫩的莖葉可以食用，當(dāng)植株成熟后，其硒含量達(dá)到最高，但由于此時(shí)植株具有特殊氣味令人難以接受，直接食用較少[10]。有學(xué)者[11-12]通過溶劑提取方式對堇葉碎米薺進(jìn)行加工利用，制得高硒含量、氣味可接受的碎米薺提取物。目前對堇葉碎米薺提取物的研究主要集中在其硒蛋白的功能性及硒的形態(tài)上[13-15]，對碎米薺粗提物和碎米薺硒多肽的生物活性研究甚少。富硒物質(zhì)的體外抗氧化活性是研究其生物活性重要組成部分，通過研究碎米薺富硒提取物的體外抗氧化活性，能夠比較幾種碎米薺提取物的抗氧化活性強(qiáng)弱。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蓳葉碎米薺、富硒酵母：湖北省恩施德源健康科技發(fā)展有限公司；

氫氧化鈉、硼氫化鉀、鐵氰化鉀、氫氧化鉀、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、過硫酸鉀、三羥甲基氨基甲烷：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、硝酸、高氯酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸：純度>99%，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-10N型，寧波生物科技有限公司；

雙功能水浴振蕩器：SHA-B型，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；

可見光分光光度計(jì)：721N型，上海儀電分析儀器有限公司；

臺式低速離心機(jī)：TD6型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

原子熒光光譜儀：AF-600型，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CE的制備 將碎米薺整株烘干打粉，過80目篩，稱取4.000 0 g碎米薺粉末，按照料液比1∶40 (g/mL)加入正己烷50 ℃攪拌脫脂4 h，抽濾，將粉末用0.1 mol/L的NaOH溶液，按照料液比1∶40 (g/mL)在50 ℃下攪拌提取8 h，2 850×g離心10 min，上清液旋蒸濃縮4倍體積后冷凍干燥得到碎米薺提取物。

1.2.2 SPR的制備 參考1.2.1，在上清液旋蒸濃縮4倍體積后用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)(pH 2.9)，4 ℃靜置過夜，2 850×g離心10 min，經(jīng)沉淀冷凍干燥得到碎米薺富硒蛋白。

1.2.3 SPI的制備 稱取4.000 0 g碎米薺蛋白，按照料液比1∶20 (g/mL)加入去離子水，堿性蛋白酶400 μL，溫度55 ℃，pH 8.0，酶解3 h，90 ℃滅酶10 min，3 000 r/min離心10 min，冷卻至溫度50 ℃，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加入中性蛋白酶400 μL，酶解3 h，90 ℃滅酶10 min，3 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)超濾(超濾膜孔徑為5 kDa)收集透過液，旋蒸濃縮4倍體積后冷凍干燥得到碎米薺多肽。

1.2.4 SPIS的制備 選用非富硒大豆肽與Na2SeO3，制備方法在文獻(xiàn)[16]基礎(chǔ)上略有修改，將大豆肽與Na2SeO3的質(zhì)量比改為9∶1。

1.2.5 總硒含量的測定 參考GB 5009.93—2017，略有改動：負(fù)高壓270 V，燈電流60 mA，輔助氣流量(Ar1)300 mL/min，載氣流量(Ar2)800 mL/min，原子化方式為火焰法，輔助陰極電流80 mA，原子化溫度300 ℃，載流為10% HCl溶液，KBH4濃度10 g/L，讀數(shù)時(shí)間15 s。

1.2.6 有機(jī)硒含量的測定 采用高效液相色譜串聯(lián)原子熒光光譜儀(HPLC-AFS)的方法測定樣品中的無機(jī)硒，詳細(xì)條件如下：負(fù)高壓320 V，原子化溫度300 ℃，燈電流90/0 mA(主/輔)，泵1轉(zhuǎn)速30 r/min，泵2轉(zhuǎn)速20 r/min，輔助氣流量(Ar1)100 mL/min，載氣流量(Ar2)600 mL/min，流動相為40 mmol/L的KH2PO4和20 mmol/L 的KCl等量均勻混合，消解液為0.15%的KI溶液，載流為10% HCl溶液，KBH4濃度20 g/L，色譜柱為PRP-X100 10 μm 4.1 mm×250 mm，采用等度洗脫的方式，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。按式(1)計(jì)算有機(jī)硒含量。

有機(jī)硒含量(mg/kg)=總硒含量(mg/kg)-無機(jī)硒含量(mg/kg)。

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1.2.7 DPPH·清除率的測定 參考圣志存等[17]的方法，改動如下：用無水乙醇代替無水甲醇配置DPPH溶液，DPPH溶液濃度由0.15 mmol/L改為0.1 mol/L，將待測樣品溶液與的DPPH溶液混合比例由1∶3改為1∶1。

1.2.8 ABTS+·清除率的測定 參考董竹平等[18]的方法，改動如下：將ABTS+工作液的添加量由1.5 mL增加至4 mL。

1.2.10 OH·清除率的測定 參考李亞男等[20]的方法，改動如下：在加入H2O2后，37 ℃恒溫時(shí)間由30 min延長至60 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，使用SPSS 23對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品中總硒及有機(jī)硒含量的測定

由于樣品中不同價(jià)態(tài)硒的種類眾多，直接檢測各價(jià)態(tài)硒的含量較為困難，所以采用HPLC-AFS法，先用HPLC將不同價(jià)態(tài)的硒分離[21]，然后經(jīng)AFS測定不同價(jià)態(tài)硒的含量。由于一些含硒物質(zhì)沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且某些有機(jī)硒分離較困難，而無機(jī)硒種類較少，分離簡單，所以采用總硒減無機(jī)硒的方式間接測定有機(jī)硒含量[22]。圖1為5種常見硒形態(tài)的色譜分離圖，其中對無機(jī)硒[Se(IV)、Se(VI)]與有機(jī)硒(SeCys2、MeSeCys、SeMet)的分離效果較好，能夠?qū)o機(jī)硒進(jìn)行定量。如表1所示，通過比較每種含硒物質(zhì)之間的總硒及有機(jī)硒含量差異，發(fā)現(xiàn)IS和SPIS的總硒含量和無機(jī)硒遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他4種含硒物質(zhì)，而SPI、SPR、CE和SY的有機(jī)硒含量遠(yuǎn)高于IS和SPIS，在3種碎米薺提取物中CE的有機(jī)硒含量最高，其次為SPI。通過比較每種含硒物質(zhì)的總硒及有機(jī)硒含量，發(fā)現(xiàn)IS和SPIS未檢測出有機(jī)硒，其硒的形態(tài)主要以無機(jī)硒形式存在，CE中含有少量的無機(jī)硒，而SPI、SPR和SY中的硒主要以有機(jī)硒的形式存在。說明在提取得到的含硒物質(zhì)中通過純化可降低無機(jī)硒含量，使產(chǎn)物中的硒以有機(jī)硒形式存在。

1.SeCys2 2.MeSeCys 3.Se(IV) 4.SeMet 5.Se(VI)

表1 不同含硒物質(zhì)總硒及有機(jī)硒含量Table 1 The content total selenium and organic selenium in different selenium sources mg/kg

2.2 不同含硒物質(zhì)抗氧化性

2.2.1 清除DPPH·能力 由圖2所示，不同含硒物質(zhì)清除DPPH·能力隨硒濃度的增大而增加，清除能力強(qiáng)弱依次為：SPI>CE>SY>SPR>SPIS>IS。其中SPI對DPPH·的清除能力高于其他5種含硒物質(zhì)且差異較大。CE、SPI、SPR和SY中硒主要以有機(jī)硒的形態(tài)存在[10]，而SPIS和IS中硒以無機(jī)硒的形態(tài)存在。另外SPI、CE、SPR、SPIS和SY的清除DPPH·的IC50分別為1 194，3 368，4 835，37 586，2 983 μg/L。說明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有機(jī)硒清除DPPH·能力強(qiáng)于無機(jī)硒。其中相同濃度下SPI抗氧化能力最強(qiáng)，可能是多肽分子量較小，活性成分充分暴露，與自由基接觸，從而降低自由基含量[21]；姚昭等[22]以大鼠為試驗(yàn)動物，研究有機(jī)硒與無機(jī)硒的抗氧化能力的不同，發(fā)現(xiàn)有機(jī)硒較無機(jī)硒能明顯增強(qiáng)大鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，顯著的增強(qiáng)大鼠體內(nèi)抗氧化能力。

圖2 不同含硒物質(zhì)對DPPH·清除能力比較Figure 2 The DPPH radicals scavenging ability of different selenium sources

2.2.2 清除ABTS+·能力 由圖3所示，不同含硒物質(zhì)清除ABTS+·能力隨硒濃度的增大而增加，SPI、CE、SY、SPR、SPIS、IS對ABTS+·的清除能力依次減弱。SPI、CE、SPR、SPIS、SY、IS清除ABTS+·的IC50分別為914.3，2 253，11 957，42 414，10 900，160 332 μg/L。其中SPIS和IS的ABTS+·清除能力在相同濃度下相差不大，但二者的抗氧化能力均明顯弱于SPI、CE、SY和SPR。所以導(dǎo)致其清除自由基能力較強(qiáng)。鄭時(shí)蓮等[23]也發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉清除ABTS+·的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硒酵母等物質(zhì)。

圖3 不同含硒物質(zhì)對ABTS+·清除能力比較Figure 3 The ABTS+ radicals scavenging ability of different selenium sources

圖4 不同含硒物質(zhì)對清除能力比較Figure 4 The radicals scavenging ability of different selenium sources

2.2.4 清除OH·能力 如圖5所示，在測定濃度范圍內(nèi)，6種物質(zhì)對OH·的清除率隨硒濃度的增加而增強(qiáng)，其中SPI清除OH·的能力最強(qiáng)，在硒含量為7 000 μg/L 時(shí)為50.3%，其次為CE，然后依次為SY、SPIS、SPR，IS對OH·清除率最低為3.7%。各組分對OH·清除能力差異較大，且以SPI清除能力最強(qiáng)，其中由于CE為碎米薺直接提取物，未進(jìn)行分離純化，其成分復(fù)雜，既含有蛋白、多糖等大分子物質(zhì)，又含有少量多酚、黃酮類物質(zhì)，可能由于其中抗氧化成分較多[25]。而SY為富硒酵母，測定時(shí)主要為其水提液中自由基清除劑與自由基反應(yīng)。SPR為經(jīng)純化后的硒蛋白，具有一定能與自由基反應(yīng)的基團(tuán)，但其活性部位未能充分地與自由基反應(yīng)，所以SPR的抗氧化能力與SPI相比要弱。SPIS和IS抗氧化能力較弱，可能是由于其中的硒為無機(jī)硒，而大豆多肽與無機(jī)硒螯合后其抗氧化能力強(qiáng)于同含量的大豆多肽或無機(jī)硒，但增強(qiáng)效果有限[26]。

圖5 不同含硒物質(zhì)對OH·清除能力比較Figure 5 The OH radicals scavenging ability of different selenium sources

3 結(jié)論

通過測定6種含硒物質(zhì)的有機(jī)硒含量發(fā)現(xiàn)，SPI、SPR、CE和SY中的硒主要以有機(jī)硒存在，而IS和SPIS中主要以無機(jī)硒的形態(tài)存在。對各含硒物質(zhì)進(jìn)行抗氧化分析，結(jié)果表明各含硒物質(zhì)均具有清除自由基的能力，且其抗氧化能力隨濃度的升高而逐漸增強(qiáng)；在相同硒含量下，富含有機(jī)硒的物質(zhì)比只含有無機(jī)硒的物質(zhì)抗氧化能力強(qiáng)。在碎米薺含硒物質(zhì)中，SPI的抗氧化活性最強(qiáng)，具有較高的研究和生產(chǎn)價(jià)值。

有機(jī)硒具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗疲勞等生物活性，而碎米薺提取物中有機(jī)硒含量較高，但對其含硒提取物，特別是硒多肽的功能性研究較少，其抗腫瘤、抗疲勞等生物活性還有待探索。