俞科 黃婷 劉異 俞俊鋒 吳曉芳

近年來我國甲狀腺癌的發(fā)病率逐漸升高，尤其是甲狀腺乳頭狀癌是近10年7種增長較快的惡性腫瘤之一。美國甲狀腺學(xué)會推薦，甲狀腺細針穿刺活檢術(shù)（FNAB）是目前鑒別良惡性結(jié)節(jié)的金標準。CLDN10是高遷移率族蛋白家族中的一員，是小分子非組蛋白染色體蛋白，有CLDN10基因編碼，CLDN10蛋白在胚胎發(fā)育過程中高表達，而在已經(jīng)發(fā)育成熟的組織或分化組織中低表達或無法檢測，CLDN蛋白自身無轉(zhuǎn)錄活性，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，通過結(jié)合DNA和修飾染色質(zhì)構(gòu)型來影響細胞功能活性［1］。越來越多證據(jù)證實CLDN10與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)。CLDN10可能通過靶向調(diào)節(jié)一些細胞周期相關(guān)的基因促進腫瘤細胞增殖。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年7月至2018年5月期間隨機收集杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院50例甲狀腺結(jié)節(jié)患者、50例甲狀腺癌與50例健康人，年齡32～71歲，男83例，其中健康人25例，甲狀腺良性腫瘤患者24例，甲狀腺癌患者23例；女67例，其中健康人25例，甲狀腺良性腫瘤患者26例，甲狀腺癌患者16例。健康人群從體檢人群中告知抽選，本研究獲得了本院倫理委員會批準。

1.2 RNA提取步驟 （1）取米粒大小的組織，液氮研磨；（2）將研磨好的組織粉末加到1ml的trizol中，用移液槍上下吹吸數(shù)次；（3）加200μl氯仿，渦旋混勻，4℃，13000r/min離心15min；（4）緩慢取出，用移液槍小心吸取上清液于另一新的EP管中，注意不要吸到中間層；（5）吸出來的上清液中加入等體積的異丙醇，緩慢上下顛倒混勻，然后放至-20℃冰箱中30min；（6）取出后，4℃，13000r/min離心10min；（7）去掉上清液，加入75%乙醇洗滌，4℃，13000r/min離心10min；（8）離心后去掉上清液，室溫下干燥5～10min，加入30～50μl RNase freeH2O，測濃度，于-80℃保存。

1.3 cDNA合成（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)） （1）配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液試劑為TOYOBO公司的Rever Tre Ace qPCR RT Kit試劑盒。第一步：試劑1；反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄條件：65℃，5min；冰浴 2min。第二步：試劑2；反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄條件：37℃，50min；98℃，5min；反應(yīng)完成后，放4℃?zhèn)溆谩＃?）SYBR QPCR：儀器：PCR儀 ABI 7500；試劑：TaKaRa SYBRR Premix Ex Taq TM Ⅱ（Perfect Real Time）DRR081， 取2μl DNA加 至23μlReal Time PCR 反應(yīng)體系中，總共25μl體系，反應(yīng)條件：93℃3min，93℃30s；55℃45s；72℃45s 40循環(huán)，收集溶解曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用ELISA法檢測CLDN10蛋白在不同甲狀腺組織中的表達結(jié)果癌癥組、良性結(jié)節(jié)組、正常組均采用 ELISA法檢測CLDN10蛋白在不同甲狀腺組織中表達結(jié)果，CLDN10蛋白陽性率（n）在三組中分別為癌癥組40，良性結(jié)節(jié)組為0.06，正常組為0.04。三組中癌癥組陽性率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 甲狀腺癌組織中CLDN10基因mRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達相關(guān)性分析 見表1。

表1 甲狀腺癌組織中CLDN10基因mRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達相關(guān)性

2.3 甲狀腺癌組織中CLDN10基因表達與臨床相關(guān)性分析 見表2。

表2 甲狀腺癌組織中CLDN10基因表達與臨床相關(guān)性分析（n）

2.4 甲狀腺癌患者單因素及多因素生存分析 見表3。

表3 甲狀腺癌患者單因素及多因素生存分析

3 討論

高遷移率蛋白（CLDN）A2蛋白是一種非組蛋白染色體蛋白，其能通過與染色質(zhì)結(jié)合而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，或直接與相關(guān)蛋白發(fā)生作用，繼而調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響腫瘤等發(fā)生。CLDN10在大多數(shù)腫瘤中均有高度表達，如甲狀腺癌、結(jié)腸癌［2］、肺癌［3］和胃癌［4］等，而在正常組織中均不表達。本研究探討CLDN10基因的表達水平與甲狀腺結(jié)節(jié)和甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)性，對甲狀腺結(jié)節(jié)和甲狀腺癌的診斷、預(yù)防和臨床治療提供幫助。

本研究采用ELISA法及real time-PCR檢測對甲狀腺癌患者、甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者以及健康人的CLDN10基因進行采集并進行分析，得出甲狀腺癌患者的CLDN10表達陽性率明顯高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)和健康人兩組，提示CLDN10基因在甲狀腺癌中高度表達。CLDN10目前已被公認為是一種新的癌基因，認為其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用可能與參與調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以及破壞DNA修復(fù)系統(tǒng)等相關(guān)［5］。Olson等［6］表明CLDN10可能通過pRB途徑直接活化E2F1的活性，從而促進腫瘤細胞異常增殖。

本研究對甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后進行單因素生存分析發(fā)現(xiàn)CLDN10、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否侵犯腺體是其危險因素，進一步多因素生存分析發(fā)現(xiàn)CLDN10、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否侵犯腺體是其獨立預(yù)測因素，而腫瘤大小不再是其獨立預(yù)測因素，提示CLDN10基因可促進甲狀腺腫瘤的發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可能因為CLDN10基因還通過靶向調(diào)節(jié)一些相關(guān)的基因從而促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［7］。蔡菁［8］認為CLDN10蛋白表達水平較高常預(yù)示有遠處轉(zhuǎn)移或患者的生存時間較短。研究還發(fā)現(xiàn)CLDN10能夠促進上皮細胞間質(zhì)化（EMT），從而導(dǎo)致甲狀腺腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強［9］。CLDN10還可以作為甲狀腺癌患者預(yù)后判斷的指標。Belge等［10］研究提示CLDN10檢測在鑒別良、惡性甲狀腺腫瘤方面的敏感度和特異度分別為95.9%和93.9%，這對于甲狀腺腫瘤切除術(shù)中的冷凍切片病理學(xué)檢查具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)CLDN10在甲狀腺乳頭狀癌患者中顯著表達，同時與腫瘤轉(zhuǎn)移及腺體侵犯與否有關(guān)，是判斷甲狀腺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子，對臨床治療指導(dǎo)及預(yù)后判斷具有重要意義。