胡玲瓏 王菊香 周海霞 李原

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是非嗜肝病毒感染引起兒童肝損害的常見病原體，原發(fā)性急性EBV感染可導致82%的患兒出現(xiàn)肝功能損傷［1］，大部分患兒的癥狀會在治療1周內(nèi)減退［2］。目前對EBV感染導致肝功能損傷的機制尚未完全明確。探索EBV感染后機體內(nèi)與肝功能損害分子的表達情況，將為EBV感染導致肝功能損傷的防治提供新的思路和策略，有助于闡明EBV感染誘導肝功能損傷的內(nèi)在分子機制。Caspase7/12是導致肝細胞凋亡的主要分子蛋白，但是否與原發(fā)性EBV感染導致的肝功能損傷存在相關(guān)性，目前尚未明確。本課題通過收集患兒肝功能數(shù)據(jù)，并采用ELISA法檢測患兒血液中肝細胞損傷相關(guān)分子蛋白的表達，探索原發(fā)性EBV感染肝功能損害與caspase7/12表達變化的相關(guān)性及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至12月在本院住院治療的原發(fā)性EBV感染患兒236例，EBV-IgM檢測均為陽性，其中伴有肝功能損傷的162例為肝功能異常組，分別檢測其急性期及恢復期實驗室指標，恢復期抽血時間為住院治療第7天，肝功能正常的74例為肝功能正常組，年齡1～14歲；肝功能異常組按年齡再分為4個亞組，包括幼兒組（1～3周歲）37例，學齡前組（4～6周歲）41例，學齡組（7～10周歲）35例，青少年組（11～14周歲）49例。收集相關(guān)的肝功能數(shù)據(jù)。標本采集獲得患者或家屬知情同意，本研究通過本院倫理委員會審核同意。

1.2 ELISA方法檢測血清caspase-7/12蛋白的表達水平 Caspase-7/12ELISA試劑盒為美國PeproTech公司生產(chǎn)；抗Caspase-7/12抗體購自英國abcom公司提供。取caspase-7/12酶聯(lián)免疫試劑盒，室溫下靜置30 min，每孔加50μl標準樣品或待測樣品，留2孔為空白對照孔；塑料薄膜覆蓋微孔板，孵育2h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔加50μl生物素標記的抗caspase-7/12抗體，塑料膜封板，孵育2h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔依次序加入顯色劑A和顯色劑B，避光室溫孵育30 min；加入反應終止液100μl，自動酶標儀于450nm處測定各孔的光密度（OD）值；以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)樣品所測OD值確定其濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗，計數(shù)資料應用χ2檢驗，兩組數(shù)據(jù)采用雙變量相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能異常組和肝功能正常組以及肝功能異常組急性期和恢復期各肝功能指標比較 肝功能異常組谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）數(shù)值明顯高于肝功能正常組（P＜0.001）；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和總膽紅素（TBLL）差異均無統(tǒng)計學意義。肝功能異常組中急性期和恢復期進行比較ALT差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），其余差異均無統(tǒng)計學意義（見表1）。

表1 肝功能異常組中急性期與恢復期ALT、AST和TBLL的比較（x±s）

2.2 肝功能異常組中各年齡分組間ALT差異比較 青少年組ALT與其它各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），余指標在各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 肝功能異常組中各年齡組ALT、AST和TBLL的比較（x±s）

2.3 肝功能異常組和肝功能正常組間caspase-7/12比較 見表3。

表3 肝功能異常組和肝功能正常組間caspase-7/12比較（x±s）

2.4 肝功能異常組急性期和恢復期caspase-7/12比較 見表4。

表4 肝功能異常組急性期和恢復期caspase-7/12比較

2.5 肝功能異常組中各年齡組間caspase-7/12比較 肝功能異常組中按年齡分4個亞組，只有青少年組的caspase-7/12與其它組的比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），余各組之間的caspase-7/12兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表5）。

表5 肝功能異常組中各年齡組caspase-7/12的表達水平比較（x±s）

2.5 肝功能異常組急性期和恢復期caspase-7/12與ALT相關(guān)性分析 肝功能異常組中急性期caspase-7/12的表達水平與ALT存在線性相關(guān)（r=0.965，P＜0.001）（見圖1）。

圖1 肝功能異常組急性期ALT與caspase-7/12的相關(guān)性分析

3 討論

EBV是臨床上最為常見的導致兒童肝損傷的非嗜肝病毒，屬4型皰疹類病毒。肝功能損傷是原發(fā)性EBV感染最為常見的并發(fā)癥之一，但EBV感染如何導致肝損傷，其病理生理機制目前尚未完全明確。新的國內(nèi)研究表明，EBV感染與乙肝病毒感染誘導的肝損傷存在相似性，可能與B淋巴細胞活動存在某種協(xié)同作用［3］；Zekri在研究臨床丙肝時發(fā)現(xiàn)，如果EBV感染處于活動期，患者的轉(zhuǎn)氨酶升高明顯［4］；在2000年時有研究揭示EBV感染可以激活機體免疫能力相關(guān)的因子，進而導致各臟器損傷，主要表現(xiàn)為細胞的凋亡［5］。

在誘導細胞凋亡的整個過程中，細胞內(nèi)caspase系列蛋白酶的激活起著重要作用。目前已經(jīng)明確的凋亡通道有三種，分別是caspase-8參與傳遞的細胞外信號凋亡通路，caspase-9參與介導的線粒體途徑誘導的細胞凋亡，以及caspase-12參與誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞凋亡信號通路，在這三條caspase參與介導的細胞凋亡信號通路，最后都需經(jīng)過caspase-7 起效應［6］。眾多臨床實驗的研究文獻提示在肝炎患者中，肝細胞的損傷一般表現(xiàn)為凋亡的過程，并且和caspase系列蛋白分子依賴的細胞凋亡過程緊密相關(guān)，其中介導細胞凋亡信號通路的caspase-7/12作用最為顯著，在一些研究乙肝、丙肝的臨床實驗文章中，絕大部分患者血清中caspase-7/12的表達水平出現(xiàn)明顯升高［7-8］，Masuoka HC在細胞實驗中通過使用caspase抑制劑來治療丙肝，取得了顯著的效果［9］，但caspase-7/12與原發(fā)性EB病毒感染誘導的肝功能損傷是否存在內(nèi)在的相關(guān)性，目前尚未完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性EBV感染患兒血清中 caspase-7的表達水平明顯上升，且肝功能異常組中ALT、caspase-7/12的表達水平明顯高于肝功能正常組。既往在對丙肝的研究提示在肝炎患者中caspase-7/12表達水平的上升可直接誘導細胞的凋亡，導致肝功能的損傷，而采用caspase的抑制劑后，caspase-7/12表達下降，部分患者肝功能恢復正常。在肝功能異常組患兒中，急性期患兒的caspase-7/12以及ALT表達水平明顯高于恢復期患兒，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)當EBV感染后，急性期caspase7/12的表達與ALT的升高存在線性相關(guān)，提示原發(fā)性EBV感染所致肝功能的損傷與caspase7/12之間存在密切的內(nèi)部聯(lián)系。同時根據(jù)年齡分組，青少年組的caspase-7/12以及ALT表達水平明顯高于其它3組，與香港兒童EBV感染導致肝功能損傷的研究中發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長肝功能的損害越明顯的結(jié)果一致［10］。

因此，caspase-7/12的高表達與兒童原發(fā)性EBV感染所致的肝功能損害密切相關(guān)，同時ALT的升高與caspase-7/12的表達水平存在線性相關(guān)。