王敏，呂媛媛，薛凌，鄭斌嬌，管敏鑫

（溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種主要累及青年男性，導(dǎo)致雙眼快速無痛性視力減退的母系遺傳性眼病。1871年首次出現(xiàn)對(duì)該病癥狀及遺傳特性的報(bào) 道[1-2]。線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）突變是該病的分子致病基礎(chǔ)之一[3-4]。m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變位點(diǎn)是最主要的引起LHON發(fā)病的原發(fā)位點(diǎn)[3，5-9]。在歐洲人群中，由這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)引起的LHON患者占90%～95%，而在中國人群中3 個(gè)突變位點(diǎn)只占約50%[10-11]。LIANG等[11]對(duì)1 218例中國漢族LHON家系統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變分別占總?cè)藬?shù)36.12%、4.84%和1.48%，與JIA等[12]對(duì)903例中國LHON人群3個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)的檢測(cè)基本一致（分別為34.6%、3.3%和0.4%）。因此，篩查LHON患者線粒體基因組中是否存在3個(gè)原發(fā)突變，成為LHON的重要診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。眾所周知，血液樣本是基因組DNA的極佳來源，然而在流行病學(xué)調(diào)查中，需要采集大量樣本，抽取血液樣本很困難且是侵入性的，所以常需要替代來源。根據(jù)之前的報(bào)道，從口腔黏膜細(xì)胞分離的DNA已成功用于基因檢測(cè)分析[14-16]。在本研究中，使用口腔拭子收集口腔黏膜細(xì)胞來提取DNA，該研究分2個(gè)階段進(jìn)行。第一階段，將口腔黏膜細(xì)胞樣本與血液樣本提取的DNA從DNA濃度、純度和完整性各方面進(jìn)行比較。第二階段，進(jìn)行了基于PCR的焦磷酸測(cè)序、斑點(diǎn)雜交和Southern blot分析，以評(píng)估使用口腔黏膜細(xì)胞DNA檢測(cè)m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變的可行性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院就診的3例基因檢測(cè)確定為m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變的LHON患者和2個(gè)無血緣關(guān)系且身體健康的對(duì)照樣本（C049、C003）。根據(jù)《赫爾辛基宣言》原則，患者在參加本研究之前認(rèn)真閱讀并簽署知情同意書，本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)受檢者進(jìn)行血液樣本和口腔黏膜細(xì)胞樣本的采集。受檢者必須在采集樣本前1 h內(nèi)避免吸煙、飲酒或進(jìn)食，以減少食物顆?；蚱渌庠次镔|(zhì)影響樣品的可能性[12]。所有參與者在樣本收集前需用自來水漱口10 s，然后用棉簽刮左側(cè)臉頰內(nèi)部上下牙床處黏膜，用刷牙的力度上下擦動(dòng)，同時(shí)旋轉(zhuǎn)拭子，讓拭子頭部充分接觸口腔黏膜，重復(fù)此動(dòng)作上下刮拭10次，最后用同樣的方法刮右側(cè)口腔黏膜，采集口腔拭子3根。將棉簽風(fēng)干30～60 min并置于密封的干燥劑塑料袋中。同時(shí)，受檢者自愿提供2 mL外周血，血液樣本儲(chǔ)存在抗凝管中。然后將口腔黏膜細(xì)胞樣本和血液樣本立即送到實(shí)驗(yàn)室，并在4 ℃下儲(chǔ)存以防止DNA降解。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量：①手工法：使用無菌鑷子將風(fēng)干棉簽表面上的棉花撕脫，并轉(zhuǎn)移到含有600 μL 細(xì)胞裂解緩沖液和3 μL蛋白酶K的2 mL無菌離心管中。將混合物在55 ℃裂解12 h。孵育完成后，向混合物中加入600 μL預(yù)冷的乙酸鉀，并將混合物在冰上靜置10 min。然后將混合物離心：4 ℃、 12 000 r/min、10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL無菌離心管中，并加入600 μL預(yù)冷的異丙醇?；靹蚝?，將混合物在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。棄上清液，用600 μL無水乙醇將沉淀物重懸，并在室溫下以12 000 r/min離心3 min。棄上清液。65 ℃、40 min干燥DNA后，向離心管中加入50 μL ddH2O溶解DNA。用分光光度法測(cè)DNA在260 nm和280 nm處的吸光度值來測(cè)定全基因組DNA的濃度和純度。②試劑盒法：根據(jù)口腔拭子的規(guī)格，使用QIA amp DNA Mini Kit（50）按照說明書提取口腔黏膜細(xì)胞DNA。根據(jù)HiPure Tissue DNA Mini Kits說明書來提取血液DNA。通過分光光度法測(cè)DNA在260 nm和280 nm處的吸光度值來測(cè)定全基因組DNA的濃度和純度。通過將DNA濃度與DNA樣品的最終體積相乘來計(jì)算DNA產(chǎn)量。

1.2.2 m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A 突變檢測(cè)：針對(duì)存在m.11778G＞A、m.14484T＞C 和m.3460G＞A突變的鑒定詳見文獻(xiàn)[17]。使用特異性寡核苷酸引物對(duì)突變者的包含突變位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即擴(kuò)增含m.G11778A突變的11 654～11 865片段、含m.T14484C突變的14 260～14 510片段、含m.G3460A突變的3 108～3 717片段[18]。具體來講，為了檢測(cè)m.T14484C突變，以全基因組DNA為模板，用mtDNA 14 000～14 998位置對(duì)應(yīng)的PCR特異性引物來擴(kuò)增得到第1段PCR產(chǎn)物，以排除可能的核假基因的共擴(kuò)增[19]。然后，以第1 段PCR產(chǎn)物作為模板，用m.DNA 14 260～14 510位置的特異性引物來擴(kuò)增得到第2段PCR產(chǎn)物（251 bp）。然后取1 μL提取的DNA，PCR反應(yīng)總體系為25 μL，包含2 pmol/L相應(yīng)的特異性引物、 5 mol/L dNTP、37.5 pmol/L MgCl2、2 μL 10× ExTaqbuffer（不含Mg2+）、0.5 U Taq DNA聚合酶和 18 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 3 min、變性94 ℃ 30 s、退火56 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 30 s、35 個(gè)循環(huán)，最終延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確定特異性的擴(kuò)增條帶后，將10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物送上海六合華大基因科技公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用CodonCode Aligner軟件與經(jīng)過校正的劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列（GenBank輸入編號(hào)：NC_001807）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后用Chromas 2.0軟件讀取測(cè)序結(jié)果的峰圖文件，進(jìn)行確認(rèn)或排除。

1.2.3 斑點(diǎn)雜交：將25 ng PCR產(chǎn)物直接加載到帶正電荷的尼龍膜（Roche）上，用寡脫氧核苷酸探針進(jìn)行雜交分析。為了檢測(cè)MT-ND4 m.11778G＞A突變，使用特異性非放射性地高辛（digoxigenin，DIG）標(biāo) 記的寡脫氧核苷酸探針：5’-ATGATGCGACTGTGAGTGC GT-3’；對(duì)于MT-ND6 T14484C突變，使用探針：5’-ATGA TGGTTGTCTTTGGAT-3’；對(duì)于MT-ND1 G3460A突變，使用探針：5’-GGCGTCAGCGAAGGGTTGTAG-3’。通過用DIG Oligo-nucleotide Tailing Kit（Roche）使寡脫氧核苷酸探針標(biāo)記上DIG。將尼龍膜放在含有5 mL DIG Easy Hyb（Roche）雜交液的雜交瓶中，56 ℃雜交爐中雜交16 h。雜交后，洗膜程序?yàn)椋耗猃埬ぴ谑覝叵略?×SSC ＆ 0.1% SDS中洗滌2次，每次 5 min；然后在37 ℃，0.5×SSC ＆ 0.1% SDS中洗滌2次，每次15 min；用DIG Wash and Block buffer、 Anti-digoxigenin-AP、Fab fragments和CDP-Star（Ro-che）檢測(cè)DIG標(biāo)記的探針[20-22]。

1.2.4 Southern blot：將50 ng PCR產(chǎn)物進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后，將凝膠上的PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)印跡到帶正電的尼龍膜（Roche）上，55 ℃雜交探針過夜，第2天檢測(cè)探針，方法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度和純度比較 手工法和試劑盒法從口腔黏膜細(xì)胞和血液樣本中提取的DNA濃度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜細(xì)胞DNA純度低于用試劑盒法提取的口腔黏膜細(xì)胞和血液樣本DNA的純度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明了口腔黏膜細(xì)胞用2種方法提取的DNA產(chǎn)量與血液樣本相似，但是用試劑盒法提取的DNA的純度更高。見表1。

表1 不同樣本來源的DNA濃度和純度的比較（±s）

表1 不同樣本來源的DNA濃度和純度的比較（±s）

與試劑盒法比：aP ＜0.05

DNA來源 n DNA濃度（ng/μL） DNA純度（A260/A280） DNA總量（μg）口腔黏膜拭子 手工法 5 47.0±12.0 1.37±0.19a 2.35±0.60 試劑盒法 5 50.4± 9.9 1.70±0.08 2.52±0.49靜脈血 5 55.6± 7.3 1.81±0.01 2.78±0.37

2.2 來自口腔黏膜細(xì)胞和血液樣本鑒定m.G11778A、 m.T14484C和m.G3460A突變的比較 對(duì)口腔黏膜細(xì)胞和血液樣本DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示口腔黏膜細(xì)胞樣本和血液樣本的測(cè)序結(jié)果一致，突變組均可以檢測(cè)到相應(yīng)的點(diǎn)突變，而對(duì)照組DNA為野生型。2種樣本用測(cè)序方法檢測(cè)m.G11778A、m.T14484C和m.G3460A突變的結(jié)果一致，初步說明口腔黏膜細(xì)胞可以用于檢測(cè)這3個(gè)點(diǎn)突變。見圖1。

2.3 斑點(diǎn)雜交和Southern blot檢測(cè)口腔黏膜細(xì)胞和血液樣本突變的比較 采用斑點(diǎn)雜交和Southern blot分析檢測(cè)受檢者是否存在m.G11778A、m.T14484C 和m.G3460A突變?？梢詸z測(cè)到?jīng)]有這些突變位點(diǎn)的對(duì)照組樣本，而不能檢測(cè)到具有這些點(diǎn)突變的突變組樣本。此外，斑點(diǎn)雜交和Southern blot分析結(jié)果表明，從DNA1、DNA2和DNA3擴(kuò)增的3種PCR產(chǎn)物的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步驗(yàn)證了用患者的口腔黏膜細(xì)胞可以用于m.G11778A、m.T14484C和m.G3460A突變的檢測(cè)。見圖2。

圖1 3個(gè)突變組（WZ1345、WZ1481、WZ1478）和2個(gè)對(duì)照組（C049、C003）樣品的部分測(cè)序峰圖

圖2 斑點(diǎn)雜交和Southern blot檢測(cè)口腔黏膜細(xì)胞和血液樣本突變的比較

3 討論

LHON是一種遺傳性疾病，來自不同種族背景的80%～95%的LHON家系被診斷為具有3種主要的線粒體G11778A、T14484C和G3460A突變[10]。本研究表明，使用口腔拭子進(jìn)行DNA收集用來檢測(cè)線粒體G11778A、T14484C和G3460A突變是可靠的?？谇皇米涌商崛∽銐蛄康腄NA，其純度足以進(jìn)行PCR及后續(xù)的測(cè)序試驗(yàn)等，并且與血液樣本一樣準(zhǔn)確[23-24]。同時(shí)口腔拭子收集是無創(chuàng)的，可以很容易地在家里進(jìn)行[25-26]。對(duì)于所有研究對(duì)象，從口腔黏膜細(xì)胞和血細(xì)胞中提取的DNA確定的測(cè)序結(jié)果、斑點(diǎn)雜交結(jié)果和Southern blot結(jié)果是相同的。此外，口腔拭子可以在沒有醫(yī)療監(jiān)督的情況下收集，也適用于嬰幼兒，并且結(jié)果不受室溫條件的影響[26]。這提供了在沒有靜脈采血條件的家庭和中心收集的機(jī)會(huì)，因?yàn)榭谇皇米涌梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)郵件輕松地郵寄到基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，這也降低了篩選高危人群中LHON基因的門檻?？傊?，通過簡單的口腔拭子技術(shù)收集的口腔黏膜細(xì)胞的DNA是血液細(xì)胞DNA的準(zhǔn)確且實(shí)用的無創(chuàng)替代物，可用于LHON的3個(gè)主要點(diǎn)突變的檢測(cè)。

與從血液樣品中分離DNA相比，口腔拭子方法的局限性是較低的DNA量和質(zhì)量。因此，對(duì)于獲得的材料用于臨床或研究目的大的其他LHON相關(guān)的突變的測(cè)量是有限的。另一個(gè)需要考慮的重要問題是在家中家庭成員之間交換口腔拭子的風(fēng)險(xiǎn)。最后，與從血細(xì)胞中分離DNA相比，從口腔拭子中分離DNA因?yàn)榉跤龝r(shí)間更長，所以更耗時(shí)。然而，與靜脈穿刺消耗的成本相比，用口腔拭子收集DNA的勞動(dòng)強(qiáng)度更低[27]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，使用口腔拭子從口腔黏膜細(xì)胞中收集DNA可提供數(shù)量足夠和質(zhì)量良好的DNA，用于LHON相關(guān)的3種主要線粒體點(diǎn)突變的檢測(cè)?？谇皇米右部梢杂米髯晕夜芾淼泥]寄測(cè)試，使用這種方便的無創(chuàng)技術(shù)，更有利于弱勢(shì)群體（如兒童）的LHON相關(guān)的3種原發(fā)性線粒體突變的篩查。