鄭聲星，潘靜怡，谷麗君，楊靜想，陳新甌，李明，金勝威

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325027）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床上常見的病死率極高的急危重癥[1-2]。成纖維細(xì)胞作為最廣泛間質(zhì)組成細(xì)胞，在ARDS早期可過度增殖并產(chǎn)生膠原蛋白，啟動纖維化程序，最終導(dǎo)致肺纖維化[3]。研究表明成纖維細(xì)胞可作為炎癥效應(yīng)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子-α及各種炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素-8、6、10并且高表達(dá)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等[4]。保護(hù)素DX（PDX）為內(nèi)源性抗炎促炎癥消退介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用[5]。我們曾報道PDX能抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[6]，然而PDX對于原代成纖維細(xì)胞早期纖維化增殖及炎癥反應(yīng)的影響仍然未知。故本研究培養(yǎng)原代小鼠肺成纖維細(xì)胞，觀察PDX對肺成纖維細(xì)胞COX-2合成、PGE2表達(dá)以及其纖維化增殖轉(zhuǎn)化、膠原蛋白合成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 PDX購于美國Cayman公司，內(nèi)毒素（LPS，E．coilserotype 055：B5）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG購于美國Sigma公司，重組TGF-β1購于美國Peprotech公司，胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購于美國Life Technologies公司，BrdU細(xì)胞增殖試劑盒購于英國Promega公司，PGE2ELISA試劑盒購于美國R＆D公司，RNeasy試劑盒購于美國Qiagen公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，兔抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人Vimentin（波形蛋白）單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體、兔抗人F4/80單克隆抗體以及兔抗人細(xì)胞角蛋白-8（cytokeratin-8）單克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng)：參照我們之前培養(yǎng)成纖維細(xì)胞方法[7]。具體如下：小鼠稱體質(zhì)量，腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉，完整取出心、肺、氣管，分離肺并除去心臟和大氣道，置于放有預(yù)冷的PBS（青霉素100 IU/mL、鏈霉素 100 IU/mL）的無菌培養(yǎng)皿中，反復(fù)用預(yù)冷的PBS液沖洗，用小剪刀將肺組織剪碎（＜1 mm3），加入0.25%胰蛋白酶（37 ℃預(yù)溫）適量，用吸管反復(fù)吹打1.5 min， 加入含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，置于培養(yǎng)皿中，再加入少量15% FBS的DMEM培養(yǎng)液懸浮組織塊，加入培養(yǎng)液以不飄起組織塊為宜。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d細(xì)胞爬出，加15% FBS的DMEM培養(yǎng)液（勿讓組織飄起）。細(xì)胞接近融合時，按1:2接種傳代，40 min后換培養(yǎng)液（差速貼壁法）。4～6代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 HE染色：將傳代的成纖維細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種于24孔板內(nèi)，吸棄上清液，加95%乙醇50 min，加入蘇木素20 min染核，純凈水洗1遍，0.1%鹽酸乙醇分化1 min，再用純凈水洗1遍，溫水返藍(lán)1 min，最后伊紅染5 min，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫熒光鑒定：將傳代的成纖維細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL， 接種于24孔板內(nèi)，吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入含4%多聚甲醛的0.01 mol/L PB（pH 7.2）1 mL，室溫下固定30 min，PBS洗3次，含0.2% Triton的PBS洗2次，再PBS洗2次，10%山羊血清的0.01 mol/L PBS（pH 7.2）封閉40 min（室溫），保持濕度一抗孵育過夜（4 ℃），次日晨用PBS洗3次，每次5 min，加結(jié)合有FITC的二抗（避光）室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI復(fù)染核15 min，PBS洗1次，熒光顯微鏡（Nikon eclipse 90i，Tokyo，日本）下觀察檢測成纖維細(xì)胞vimentin、CD31、F4/80以及cytokeratin-8的表達(dá)情況。

1.2.4 實驗分組：LPS誘導(dǎo)急性炎癥模型：①Control組：無任何處理；②LPS組：LPS（1 μg/mL）刺激6 h；③PDX+LPS組：PDX加LPS（1 μg/mL）刺激6 h。 TGF-β1誘導(dǎo)纖維化增殖模型：①Control組：無任何處理；②不同濃度TGF-β1組：不同時間點（24、48、72 h）給予不同濃度TGF-β1（1、10、20 ng/mL）； ③不同濃度PDX+TGF-β1組：給予不同濃度（0、1、10、100 nmol/mL）PDX加上TGF-β1（10 ng/mL）刺激48 h。藥物刺激前均無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.5 Western blot檢測COX-2 蛋白的表達(dá)：取 1 μg/mL LPS合并PDX誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后的肺成纖維細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上孵育50 min， 12 000 r/min離心20 min。采用BCA試劑盒測蛋白濃度。取總蛋白進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)膜上。把膜放入含5 g脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入COX-2一抗1:1 000，4 ℃搖動過夜。次日室溫下TBST洗膜3次，每次15 min，接著加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1:2 000稀釋），在室溫下輕輕搖動1 h，然后洗膜3次，每次15 min。最后按化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒（ECL）要求加ECL試劑，室溫下溫育2 min后儀器進(jìn)行曝光。在凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）中測量目的蛋白特異性條帶相對表達(dá)強(qiáng)度（灰度值），再與內(nèi)參相對表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行比較，得出相對比值。

1.2.6 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中PGE2的含量：LPS 和（或）PDX作用結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，2 000 r/min 離心 5 min后待測。按照R＆D公司ELISA試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞上清液中PGE2的含量。

1.2.7 BrdU細(xì)胞濃度測定試劑盒檢測細(xì)胞存活度：將分離純化的4-6代細(xì)胞以4×105～8×105cells/mL 進(jìn)行鋪板（96孔，100 μL/孔，5復(fù)孔）；細(xì)胞去血清化24 h后，應(yīng)用PDX、TGF-β1等對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)24 h后，加入20 μL試劑盒增殖溶液。培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h。每孔內(nèi)加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度值，應(yīng)用培養(yǎng)液替代樣品為陰性對照組。各孔檢測的吸光度值減去陰性對照組的吸光度值。

1.2.8 Real time PCR檢測膠原蛋白1α1（collagen 1α1）、膠原蛋白1α2（collagen 1α2）、α-SMA和纖連蛋白（fibronectin）mRNA的表達(dá)：取10 ng/mL TGF-β1+ PDX（100 nmol/mL）誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞，根據(jù)說明書使用RNeasy試劑盒純化RNA。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。PCR引物序列如下：collagen 1α1的正向引物為5’-GAAGCACGTCTGGTTTGGA-3’，反向引物為5’-ACTCG AACGGGAATCCATC-3’；collagen 1α2的正向引物為5’- CCAACAAGCATGTCTGGTTAGGA-3’，反向引物為5’-TCAA ACTGGCTGCCACCAT-3’；α-SMA的正向引物為5’-GTCCCA GACATCAGGGAGTAA-3’，反向引物為5’-TCGGATACTTCAG CGTCAGGA-3’；fibronectin的正向引物為5’-AAGACCA TACCTGCCGAATG-3’，反向引物為5’-GAACATGACCGATTT GGACC-3’。把板置于LightCycler 480實時定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行檢測，95 ℃ 7 min預(yù)熱，95 ℃ 18 s，56 ℃ 18 s，第二步至第三步共進(jìn)行40個循環(huán)。根據(jù)CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，并根據(jù)2-ΔΔCT計算基因相對表達(dá)水平[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 以GraphPad5.0軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因數(shù)方差分析進(jìn)行組間比較，再進(jìn)行方差齊性檢驗后，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’sT3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺成纖維細(xì)胞純化及鑒定 組織塊貼壁培養(yǎng)1～2 d后顯微鏡下可見長梭型細(xì)胞從組織塊中爬出，3～5 d后細(xì)胞生長迅速并接近融合。成纖維細(xì)胞較大，呈突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，核橢圓形，核仁明顯，細(xì)胞伸出多個突起（見圖1）。傳代后的肺成纖維細(xì)胞幾乎長滿整個培養(yǎng)瓶，偶見其他非成纖維細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，但連續(xù)傳4～6代后，細(xì)胞增殖能力逐漸下降。免疫熒光檢測肺成纖維細(xì)胞呈vimentin（成纖維細(xì)胞標(biāo)記）陽性，CD31（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志）陰性，F(xiàn)4/80（巨噬細(xì)胞標(biāo)記）陰性，cyto-keratin-8（上皮細(xì)胞標(biāo)記）陰性，見圖2。

圖1 傳代后肺成纖維細(xì)胞（HE，×200）

2.2 PDX對于LPS刺激原代肺成纖維細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示正常小鼠原代肺成纖維細(xì)胞存在COX-2蛋白微量表達(dá)；LPS刺激誘導(dǎo)下，COX-2蛋白大量表達(dá)；PDX能抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2蛋白的表達(dá)。Control組與LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），LPS組與LPS+PDX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.3 PDX對于LPS刺激原代肺成纖維細(xì)胞上清液PGE2含量的影響 PDX能抑制LPS誘導(dǎo)后原代肺成纖維細(xì)胞上清中PGE2的含量。Control組與LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），LPS組與LPS+PDX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

2.4 不同濃度TGF-β1刺激不同時間后細(xì)胞存活度檢測 在TGF-β1的刺激下，小鼠原代肺成纖維細(xì)胞出現(xiàn)了增殖反應(yīng)，3個濃度TGF-β1組與Control組相比，均出現(xiàn)了增殖反應(yīng)（P＜0.01）。在24、48 h，TGF-β110 ng/mL組與其他各濃度組比較細(xì)胞增殖反應(yīng)更大 （P＜0.05），在各個濃度的不同刺激時間里，48 h時細(xì) 胞增殖反應(yīng)較大（P＜0.05），因此可以確定TGF-β1刺激致細(xì)胞纖維增殖模型的最適刺激濃度為10 ng/mL， 最佳刺激時間為48 h。見圖5。

圖2 肺成纖維細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果（DAPI為細(xì)胞核染色，Merge為疊加圖，×200）

圖3 PDX抑制LPS誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)

圖4 PDX抑制LPS刺激6 h肺成纖維細(xì)胞的PGE2表達(dá)

2.5 PDX對TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞增殖的影響 實驗結(jié)果顯示，PDX呈劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞增殖。Control組與TGF-β1組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；PDX組與Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；100 nmol/L PDX組顯著抑制學(xué)報纖維化增殖，與TGF-β1+PDX 1 nmol/L組、TGF-β1+PDX 10 nmol/L組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。后續(xù)實驗選擇100 nmol/L作為PDX的濃度。見圖6。

圖5 不同劑量不同時間TGF-β1誘導(dǎo)對原代肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

圖6 PDX以劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的原代肺成纖維細(xì)胞的增殖

2.6 PDX對于TGF-β1誘導(dǎo)的原代肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成以及α-SMA和fibronectin基因表達(dá)的影響 α-SMA以及fibronectin是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物[9]。實驗結(jié)果表明，TGF-β1能促進(jìn)原代肺成纖維細(xì)胞collagen 1α1、collagen 1α2的合成以及α-SMA、fibronectin的基因表達(dá)，TGF-β1組與Control組相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；PDX能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的原代肺成纖維細(xì)胞collagen 1α1、collagen 1α2的合成以及α-SMA、fibronectin的基因表達(dá)，TGF-β1組與TGF-β1+PDX組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖7。

3 討論

圖7 PDX抑制TGF-β1誘導(dǎo)的原代肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成、fibronectin 基因及α-SMA的基因表達(dá)

ARDS分為3個階段[10]，初始化階段為急性炎癥期，炎癥期后為纖維增生期，在此期間間充質(zhì)細(xì)胞，特別是間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)如膠原蛋白[11]，如果這時炎癥還不能消退，會進(jìn)入肺纖維化階段。ARDS 3個階段互相交叉重疊，而成纖維細(xì)胞的激活是其交叉重疊的標(biāo)志[12]。成纖維細(xì)胞不僅能促進(jìn)組織修復(fù)，而且能調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生發(fā)展及消退過程[12]。我們之前的研究表明，成纖維細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下能表達(dá)COX-2并伴隨PGE2的產(chǎn)生[7]。COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類物質(zhì)的限速酶[13]，其在呼吸系統(tǒng)炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。故本研究采用LPS誘導(dǎo)原代成纖維細(xì)胞建立體外炎癥模型。

PDX是抗炎促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)家族成員之 一[5]。研究表明PDX降低活性氧生成，抑制中性粒細(xì)胞脫粒、浸潤[14]，并且能降低膿毒血癥患者的生存率[15]。本研究表明，PDX能抑制LPS誘導(dǎo)的原代肺成纖維細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)，ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，PDX能降低LPS刺激后肺成纖維細(xì)胞上清中PGE2的水平，提示在ARDS早期炎癥階段PDX能抑制炎癥瀑布樣擴(kuò)大，從而改善ARDS預(yù)后。

研究表明ARDS早期就可出現(xiàn)纖維化增殖，如增殖反應(yīng)未減弱，會導(dǎo)致臨床預(yù)后不佳[6]。這種纖維化增生階段是一種潛在的可逆狀態(tài)，被視為ARDS治療過程中的最佳靶點[16]。炎癥反應(yīng)中成纖維細(xì)胞被過度激活，分泌炎癥因子，同時過度纖維化增殖并促進(jìn)其I膠原蛋白的合成及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致肺功能障礙及肺纖維化[17]。因此可通過抑制肺成纖維細(xì)胞早期纖維化增殖及膠原蛋白的合成，促進(jìn)肺功能的恢復(fù)，改善ARDS的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。α-SMA是成纖維細(xì)胞激活的標(biāo)志。纖維化過程中I型膠原蛋白會大量合成并堆積，故影響I型膠原表達(dá)的因子是抗纖維化的研究重點[18]。TGF-β1能介導(dǎo)成纖維細(xì)胞纖維化增殖、向成纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)[19-20]。因此本實驗采用不同濃度TGF-β1刺激原代成纖維細(xì)胞不同時間建立纖維化模型，發(fā)現(xiàn)采用10 ng/mL TGF-β1刺激原代成纖維細(xì)胞48 h建立纖維化模型是比較合理的。研究發(fā)現(xiàn)PDX能抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，抑制上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其肺功能恢復(fù)[6]。本實驗結(jié)果表明PDX能通過劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的原代肺成纖維細(xì)胞的增殖，同時能抑制其I型膠原蛋白合成以及α-SMA和fibronectin基因的表達(dá)。

綜上所述，PDX能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)，抑制TGF-β誘導(dǎo)的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞纖維化增殖轉(zhuǎn)化。