宋巧,童紅梅,郭敏,王保平,彭濤,張敏

(1.甘肅醫(yī)學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000；2.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000)

甜葉菊(Steviarebaudiana)是原產(chǎn)于南美洲巴拉圭的1種菊科植物[1]，其葉片富含甜葉菊糖苷和黃酮類(lèi)成分[2].甘肅省酒泉市肅州區(qū)因氣候干燥、光照充足、晝夜溫差大、太陽(yáng)輻射強(qiáng)、沙石土壤等特殊氣候及地質(zhì)條件，種植甜葉菊具有明顯優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)品品質(zhì)及有效成分含量均高于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)[3].目前，甜葉菊在甘肅省酒泉市肅州區(qū)種植面積達(dá)2 500 hm2，種植戶(hù)達(dá)到12 000余戶(hù)，甜菊干葉產(chǎn)量達(dá)5 250 kg/hm2，高于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)，具有豐富的甜葉菊資源，但其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值較低[4].

黃酮類(lèi)化合物生理活性廣泛且毒副作用少，具有廣泛的藥用功效[5-7].文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮具有多種生理功能如抗心腦血管病、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)等作用，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域[8-10].

由于我國(guó)對(duì)甜葉菊研究的起步較晚，目前對(duì)甜葉菊的研究主要集中在甜菊糖苷的提取、栽培技術(shù)和病害防治技術(shù)、離體培養(yǎng)技術(shù)等方面[6-7,11-12]，對(duì)甜葉菊其他活性成分的研究還較為薄弱.目前，在對(duì)甜葉菊總黃酮提取工藝和抗氧化活性的研究中，主要集中在針對(duì)甜葉菊渣及發(fā)酵制劑抗氧化活性的研究方面[7,13-14]，但對(duì)甜葉菊主體產(chǎn)物—甜葉菊葉中黃酮類(lèi)化合物的提取和抗氧化活性研究鮮有報(bào)道.為進(jìn)一步挖掘甜葉菊葉的綜合利用價(jià)值，緩解甜葉菊資源過(guò)剩的問(wèn)題，本試驗(yàn)以酒泉市肅州區(qū)種植的甜葉菊葉片為原料，總黃酮提取量為檢測(cè)指標(biāo)，采用單因素、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)甜葉菊葉總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，確定其最佳提取工藝，并對(duì)甜葉菊葉黃酮提取物的抗氧化性進(jìn)行檢測(cè)，旨在為合理開(kāi)發(fā)甜葉菊資源提供必要的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜葉菊葉于2017年7月采購(gòu)于甘肅省酒泉市甜葉菊種植基地，置于烘箱中70 ℃烘干，研磨過(guò)200目篩后備用.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，中國(guó)藥品生物制品鑒定所；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

722E型可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；MS205DU天平(梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)；VORTEX-5 渦旋混合儀器(廣州啟達(dá)環(huán)保設(shè)備有限公司)；DHG-9140(A)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海予華儀器設(shè)備有限公司)；SBL-15DT超聲波恒溫清洗機(jī)(上海生科儀器有限公司)；SHB-IV雙A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；XA-1型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(南京旭析儀器有限責(zé)任公司)；Galanz微波爐G80F23ESL-XGA(B0)(廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司).

1.3 研究方法

1.3.1 甜葉菊殘?jiān)锌傸S酮浸提量的測(cè)定

1.3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精準(zhǔn)稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品7.50 mg置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液使之溶解并定容至刻度，渦旋混勻，即得0.30 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mL，(相當(dāng)于總黃酮的質(zhì)量分別為0.00、0.09、0.18、0.27、0.36、0.45 mg)置于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL的0.05 g/mL亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置6 min，然后加入0.2 mL 的0.1 g/mL硝酸鋁溶液，混勻后靜置6 min，再加入2.0 mL的1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，用60%乙醇溶液定容，渦旋混勻后靜置15 min使其充分反應(yīng)，于510 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各反應(yīng)體系的吸光度值.以總黃酮質(zhì)量x為橫坐標(biāo)，吸光度值y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.線性回歸方程為：y=0.347 0x-0.028 2，決定系數(shù)r2=0.998 5.

1.3.1.2 樣品處理及總黃酮浸提量的計(jì)算 準(zhǔn)確稱(chēng)取甜葉菊葉樣品10 g，液氮中研磨，依次在不同超聲提取時(shí)間、固液比、超聲提取溫度、乙醇濃度(V/V)條件下進(jìn)行功率為400 W超聲波提取的單因素試驗(yàn)，提取液再經(jīng)微波提取30 s，抽濾后用60%乙醇溶液定容至一定體積V，精確吸取一定體積的提取液V0，根據(jù)1.3.1.1的方法處理待測(cè)液，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮浸提量.總黃酮浸提量計(jì)算見(jiàn)式(1)：

總黃酮浸提量(mg/g)=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的總黃酮含量M(mg)/測(cè)定液體積V0(mL)×定容體積V(mL)/甜葉菊葉質(zhì)量m(g)

(1)

1.3.2 甜葉菊葉中總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)方法[6,15]，對(duì)甜葉菊葉液氮凍干研磨樣品，在超聲提取時(shí)間為60 min、超聲提取溫度60 ℃、乙醇濃度70%(V/V)在固液比1∶15(g∶mL)的條件下，固定其他條件不變，設(shè)置超聲提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min，料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，超聲提取溫度為20、30、40、50、60、70、80、90 ℃，乙醇濃度20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，以總黃酮提取量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次.按照1.3.1.2測(cè)定并計(jì)算各處理的總黃酮提取量.

1.3.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn).采用L9(34)正交表進(jìn)行組合搭配，以總黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行比較，優(yōu)化工藝參數(shù).每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，用極差分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果做直觀分析.

1.3.3 甜葉菊葉中總黃酮對(duì)·OH的清除率測(cè)定[6]參照文獻(xiàn)方法，將甜葉菊葉提取液稀釋至質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40 mg/L，準(zhǔn)確吸取2 m L上述稀釋液，依次添加6 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，渦旋混勻后室溫條件下靜置10 min，再添加6 mmol/L水楊酸2.0 mL，混勻，室溫條件下靜置30 min，于510 nm波長(zhǎng)處的吸光度Ai；同時(shí)測(cè)定用去離子水替換水楊酸時(shí)的吸光度Aj.校準(zhǔn)液是用去離子水替換總黃酮溶液，然后測(cè)定其吸光度為A0，測(cè)定其對(duì)·OH清除率.按照相同方法，分別加入相同質(zhì)量濃度的VC樣液作為對(duì)照，測(cè)定VC對(duì)·OH清除率.·OH清除率計(jì)算見(jiàn)式(2).

·OH清除率/%=[1-(Ai-Aj)]×100/A0

(2)

1.3.4 甜葉菊葉中總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率測(cè)定[16-17]依據(jù)文獻(xiàn)的方法，取7支試管，分別加入4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1緩沖液，再分別加入質(zhì)量濃度為0.250 mg/mL的甜葉菊葉黃酮提取液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6 mL，然后用水補(bǔ)齊至9.7 mL，混勻，恒溫20 min(25 ℃)，加0.3 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液(25 ℃)開(kāi)啟反應(yīng)，5 min后加4滴10 mol/L鹽酸終止反應(yīng).同時(shí)另取7支試管，用0.3 mL 10 mmol/L鹽酸為空白對(duì)照開(kāi)啟反應(yīng)，同上操作終止反應(yīng).于325 nm分別測(cè)定吸光值A(chǔ).以VC作為對(duì)照，按照相同方法，分別加入濃度為0.250 mg/mL的VC樣液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6.測(cè)定其對(duì)O2-·清除率.按照式(3)計(jì)算O2-·的清除率.

O2-·清除率/%=(A對(duì)照-A加樣)×100/A對(duì)照

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)甜葉菊葉總黃酮提取效果的影響 由圖1可知，在超聲提取時(shí)間在于60 min時(shí)，總黃酮提取量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，但當(dāng)超聲提取時(shí)間多于60 min后總黃酮提取量卻隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這可能是由于隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，超聲效果不斷增強(qiáng)，造成黃酮結(jié)構(gòu)破壞[18]，這與陳婷等[7]人的研究結(jié)果一致.因而，當(dāng)其他條件保持不變的時(shí)候，超聲提取時(shí)間設(shè)置為60 min有最大的黃酮提取量.

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)甜葉菊葉中總黃酮提取量的影響Figure 1 Effect of ultrasonic extracting time on the extraction yield of total flavonoids from stevia leaves

2.1.2 固液比對(duì)甜葉菊葉總黃酮提取效果的影響 由圖2可知，在一定條件下總黃酮的提取量隨著料液比的降低而增加，并且總黃酮提取量的上升趨勢(shì)逐漸減緩，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí)提取率達(dá)到最大，之后總黃酮提取量逐漸減小，因此選取料液比1∶20為最佳料液比.

圖2 固液比對(duì)甜葉菊葉中總黃酮提取量的影響Figure 2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from stevia leaves

2.1.3 超聲提取溫度對(duì)甜葉菊葉總黃酮提取效果的影響 由圖3可知，隨著超聲溫度的提高，甜葉菊葉中總黃酮提取量逐步增加，當(dāng)超聲溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，總黃酮提取量達(dá)到最大值，當(dāng)溫度繼續(xù)升高后，總黃酮的提取量較平穩(wěn)，甚至略有降低.可能原因?yàn)椋狠^高溫度下，分子運(yùn)動(dòng)速率加快使雜質(zhì)含量增多，同時(shí)使一部分穩(wěn)定性不好的黃酮類(lèi)化合物氧化分解而損失[19].考慮到盡可能降低高溫對(duì)總黃酮的散失和同時(shí)獲得較理想的提取率，選擇60 ℃為黃酮提取的最佳溫度.

圖3 超聲提取溫度對(duì)甜葉菊葉中總黃酮提取量的影響Figure 3 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from stevia leaves

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甜葉菊葉黃酮提取效果的影響 由圖4可知，在乙醇溶液濃度低于70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮提取量增加；當(dāng)乙醇溶液濃度高于70%以后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取量卻在減小.說(shuō)明乙醇體積濃度過(guò)大，使醇溶性雜質(zhì)不斷增加而降低總黃酮提取量[20].因此，乙醇濃度(V/V)為70%時(shí)總黃酮浸提量最高，為5.839 mg/g.

圖4 乙醇濃度(V/V)對(duì)甜葉菊葉中總黃酮提取量的影響Figure 4 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from the leaves of stevia

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表1結(jié)果進(jìn)行直觀分析可知，RA>RB>RD>RC，影響效果的主次因素為：超聲提取時(shí)間>固液比>乙醇濃度(V/V)>超聲提取溫度.從各因素水平對(duì)甜葉菊葉中總黃酮提取量的影響來(lái)看，K2A>K3A>K1A，說(shuō)明超聲提取時(shí)間60 min時(shí)總黃酮提取量最大；在固液比這個(gè)因素中，K3B>K2B>K1B，說(shuō)明固液比1∶20時(shí)總黃酮提取量最大；在超聲提取溫度因素中，K2C>K3C>K1C，說(shuō)明超聲提取時(shí)間為70 ℃時(shí)總黃酮提取量最大；在乙醇濃度(V/V)因素中K2D>K1D>K3D，說(shuō)明乙醇濃度(V/V)為70%時(shí)，總黃酮提取量最大.由K值可知最佳工藝組合為A2B3C2D2.

表1 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示.超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率有極顯著性影響(P<0.01)，固液比對(duì)總黃酮提取率影響顯著(P<0.05)，超聲提取溫度和乙醇濃度(V/V)對(duì)甜葉菊葉總黃酮提取率影響不顯著.這與表1中的極差分析結(jié)果相吻合.

表2 方差分析表

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由于正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合A2B3C2D2，在L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒(méi)有出現(xiàn)，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).在超聲提取時(shí)間60 min、固液比1∶20、超聲提取時(shí)間70 min、乙醇濃度(V/V)70%的條件下，進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明甜葉菊葉中總黃酮的平均提取量為6.672 mg/g(3次提取量分別為6.678、6.669、6.669 mg/g)，高于單因素試驗(yàn)的結(jié)果和正交試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)也高于文獻(xiàn)[7]報(bào)道的甜葉菊殘?jiān)锌傸S酮的提取率(5.928 mg/g).

2.4 甜葉菊葉中總黃酮對(duì)·OH的抗氧化性

甜葉菊葉總黃酮提取物和VC對(duì)·OH的清除率見(jiàn)圖5.相關(guān)研究表明[15,21]，黃酮類(lèi)化合物可以有效的清除自由基，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞的破壞作用，從而使細(xì)胞達(dá)到抗氧化的效果.試驗(yàn)結(jié)果表明，甜葉菊葉中黃酮和VC均對(duì)·OH有較高的清除率，甜葉菊葉的IC50(即清除率達(dá)到50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度)為25.031 mg/L時(shí)，VC的IC50為19.583 mg/L，兩者對(duì)·OH的抗氧化性在同等條件下，甜葉菊葉中總黃酮的質(zhì)量濃度是VC質(zhì)量濃度的1.28倍.雖然VC對(duì)·OH的抗氧化性要強(qiáng)于甜葉菊葉中黃酮，但從圖5可以看出，甜葉菊葉中黃酮在一定范圍內(nèi)隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，其清除率不斷增大，對(duì)·OH仍有較為明顯的清除作用.

圖5 甜葉菊葉總黃酮提取物和VC對(duì)·OH的清除率Figure 5 Scavenging ratio of the total flavonoids extract from stevia leaves and VC against hydroxyl free radicals

2.5 甜葉菊葉中總黃酮對(duì)O2-·的抗氧化性

甜葉菊葉總黃酮提取物和VC對(duì)O2-·的抗氧化性見(jiàn)圖6.由表6可以看出，甜葉菊葉中總黃酮和VC樣液均對(duì)O2-·有較為明顯的清除能力，兩者對(duì)其的清除率均與樣液的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)增長(zhǎng).在質(zhì)量濃度為16.867 mg/mL以上的范圍內(nèi)時(shí)，VC對(duì)O2-·的清除率均強(qiáng)于甜葉菊葉中總黃酮，當(dāng)VC樣液的質(zhì)量濃度為25.481 mg/mL時(shí)，對(duì)O2-·清除率達(dá)到50%，而甜葉菊葉總黃酮的IC50為28.677 mg/mL，說(shuō)明兩者對(duì)O2-·的抗氧化性在同等條件下，甜葉菊葉中總黃酮的質(zhì)量濃度是VC質(zhì)量濃度的1.13倍；但質(zhì)量濃度低于16.867 mg/mL時(shí)，甜葉菊葉中總黃酮對(duì)O2-·的清除率要強(qiáng)于VC.

圖6 甜葉菊葉總黃酮提取物和VC對(duì)O2-·的抗氧化性Figure 6 Scavenging ratio of the total flavonoids extract from stevia leaves and VC against superoxide anion free radicals

3 結(jié)論

1) 利用超聲波輔助技術(shù)提取甘肅省酒泉市肅州區(qū)所產(chǎn)甜葉菊葉中的總黃酮進(jìn)行提取，其最佳工藝條件為超聲提取時(shí)間60 min、固液比1∶20、超聲提取溫度70 ℃、乙醇濃度(V/V)70%，此條件下提取甜葉菊葉的總黃酮量為6.672 mg/g.本工藝提取甜葉菊渣中總黃酮，簡(jiǎn)單易行，成本低廉，安全可靠，有利于甜葉菊資源的合理利用.

2) 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甜葉菊葉中總黃酮具有較好的清除·OH和O2-·的能力.對(duì)·OH 的抗氧化能力上，甜葉菊葉中總黃酮的IC50為25.031 mg/L，是VC的1.28，其稍弱于VC.對(duì)O2-·的抗氧化能力上，甜葉菊葉中總黃酮的IC50為28.677 mg/mL，是VC的1.13倍；在質(zhì)量濃度為16.867 mg/mL以上的范圍內(nèi)時(shí)，甜葉菊葉中總黃酮的抗氧化能力弱于VC；質(zhì)量濃度低于16.867 mg/mL時(shí)，甜葉菊葉中總黃酮的抗氧化能力要強(qiáng)于VC.因此，甘肅省酒泉市肅州區(qū)甜葉菊葉中黃酮類(lèi)化合物有較好的抗氧化能力，是一種很好的天然自由基清除劑，在抗衰老、提高免疫等方面發(fā)揮著重要作用.