李成，賀濛初，舒迎霜，何嫣婷，馮士彬，李玉，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

脾虛證是指因脾氣血、脾陰或脾陽虧虛所呈現(xiàn)的一系列臨床證候群的抽象歸類[1]，中醫(yī)理論認(rèn)為脾主運(yùn)化為后天之本，升清降濁，統(tǒng)攝血液，為氣血生化之源，脾氣虛弱則百病由生.脾虛證的現(xiàn)代研究起于20世紀(jì)70年代末的脾虛動(dòng)物模型，至目前已涉及消化、代謝、神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等方面[2-6].作為中醫(yī)臨床常見證候之一，脾虛證常以四君子湯為基礎(chǔ)進(jìn)行治療.四君子湯是健脾益氣基礎(chǔ)方，出自《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓和炙甘草4味藥組成，臨床上多使用該方加減治療脾虛證相關(guān)疾病.已有相關(guān)研究報(bào)道了加味四君子湯具有一定的抗癌和抗衰老的功效[7-8].加味四君子湯對脾虛證的作用本質(zhì)目前仍無定論.本試驗(yàn)擬從免疫著手，采用番瀉葉復(fù)制犬脾氣虛模型，觀察其血清細(xì)胞因子水平、腸道免疫球蛋白水平以及脾臟組織形態(tài)及功能的變化，并根據(jù)其泄瀉、食少納呆、神態(tài)萎靡等癥狀對四君子湯加味當(dāng)歸、黃芪、山楂、神曲等，觀察加味四君子湯對脾氣虛犬上述指標(biāo)的作用效果，探討加味四君子湯治療脾氣虛證的作用及其機(jī)制，以期為研究健脾益氣的四君子湯加味方提供試驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1歲齡純種‘比格犬’24只，由南京亞東試驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供.試驗(yàn)前進(jìn)行常規(guī)免疫與驅(qū)蟲，定量采食，自由飲水，隔離飼喂7 d.

1.2 主要儀器

TD-100小型提取濃縮機(jī)組(浙江森力機(jī)械科技有限公司)，MK3型半自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀(美國Thermo公司)，CX31正置光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，YD-1508 R輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)，HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，DW-86L388A型-80℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，JEM-1230型透射電鏡(日本JEOL公司).

1.3 中藥和試劑

番瀉葉和加味四君子湯飲片(黨參、茯苓、麩炒白術(shù)、甘草、當(dāng)歸、黃芪、山楂、神曲等)購于安徽合肥梅山路立方大藥房；犬γ-干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素2(IL-2)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素4(IL-4)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒和Tuftsin ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅(醇溶)染液(Biosharp公司)；分泌型免疫球蛋白A(博奧森，bs-4964R)；UltraPure Agarose、SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄kit、Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen公司)；酚氯仿、異丙醇、無水乙醇(無錫展望化工有限公司).

1.4 中藥制備

番瀉葉藥液制備：準(zhǔn)確稱取5 kg番瀉葉,篩選去除雜質(zhì)，清洗，裝入紗布袋連同清洗上清液投入TD-100小型濃縮機(jī)組提取罐中，加10倍量水，75 ℃提取2次，每次40 min，合并濾液，75 ℃濃縮成1 g/mL的藥液，冷卻后4 ℃保存.

加味四君子湯的制備：加味四君子湯由黨參、茯苓、麩炒白術(shù)、甘草、當(dāng)歸、黃芪、山楂、神曲等按一定比例組方，清洗去除雜質(zhì)后連同清洗上清投入提取罐中，加10倍量水，浸泡3 h，75 ℃提取2次，每次40 min，合并濾液，75 ℃濃縮成1 g/mL的藥液，冷卻后4 ℃保存.

1.5 試驗(yàn)犬分組處理

比格犬飼養(yǎng)1周后，取24只隨機(jī)均分為4組，分別為對照組、脾氣虛組、自然恢復(fù)組和加味四君子湯組.除對照組外其余各組試驗(yàn)犬只每天按體質(zhì)量6 mL/kg劑量灌服番瀉葉藥液，分早晚2次灌服，直至出現(xiàn)符合脾氣虛泄瀉證的典型癥狀(泄瀉嚴(yán)重、食少納呆、神態(tài)萎靡、毛色枯燥、消瘦、易疲勞等[9])后，脾氣虛組犬處死取樣備用，對照組和自然恢復(fù)組犬飼喂基礎(chǔ)日糧，加味四君子湯組犬在基礎(chǔ)日糧中添加2%日糧重的加味四君子湯.試驗(yàn)期間，4組試驗(yàn)犬飼喂管理?xiàng)l件均一致，每日飼喂2次基礎(chǔ)日糧，每次150 g.保證充足潔凈飲水，犬舍每日打掃1次.常規(guī)消毒、免疫.

1.6 樣本采集

1.6.1 采血與血清制備 分別于試驗(yàn)開始當(dāng)天、造模成功后和治療結(jié)束后從空腹犬前肢靜脈采集非抗凝血，靜置后3 000 r/min離心8 min，析出血清后分裝于1.5 mL離心管，-20 ℃保存，用于檢測血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6水平.

1.6.2 脾臟及腸道組織樣本的采集 試驗(yàn)犬稱質(zhì)量、麻醉后處死放血摘取脾臟，擦干稱質(zhì)量，用于計(jì)算脾臟指數(shù)，并取樣分別置于液氮罐(用于檢測Tuftsin水平)、4%多聚甲醛(用于HE染色)和2.5%戊二醛(用于電鏡觀察)中保存；取小腸各段(十二指腸、空腸、回腸)經(jīng)生理鹽水稍沖洗后分別分裝于4%多聚甲醛(用于檢測sIgA陽性表達(dá)水平)和液氮罐(用于檢測IgA、IgG、IgM mRNA相對表達(dá)量)中保存，液氮罐中的樣本隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存.

1.7 指標(biāo)檢測與方法

1.7.1 試驗(yàn)犬血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6水平 采用ELISA法檢測，具體操作嚴(yán)格遵守ELISA試劑盒說明書，在MK3型半自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀上測得D值后，再在Excel中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品已知濃度和D值建立標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算樣本濃度.

1.7.2 試驗(yàn)犬脾臟樣本處理超低溫冰箱中取出脾臟樣本，研磨離心取上清，ELISA法檢測組織中Tuftsin水平，具體操作嚴(yán)格遵守試劑盒說明書.取出4%多聚甲醛中的脾臟樣本，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色觀察脾臟病理變化.脾臟樣本在2.5%戊二醛固定一段時(shí)間后，沖去固定液，加入1%鋨酸固定，經(jīng)梯度酒精后環(huán)氧樹脂包埋，切片，日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu).

1.7.3 試驗(yàn)犬小腸樣本處理取出4%多聚甲醛中的小腸樣本，IHC檢測小腸各段sIgA陽性表達(dá)水平，設(shè)置陰性對照，以PBS代替一抗、二抗.試驗(yàn)結(jié)束后使用Olympus顯微鏡Images圖像分析系統(tǒng)對腸道免疫組化結(jié)果拍照，同一組織選擇3個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，對圖片進(jìn)行分析，結(jié)果以平均光密度(Density mean)表示.

依據(jù)GeneBank中犬IgA、IgG、IgM以及內(nèi)參Actin的序列(GeneBank序列號為AY576788.1、EF207771.1、AF354265.1、NM_001195845.2)，使用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1).Trizol試劑盒提取小腸各段RNA后，采用SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并合成cDNA，Sybr qpcr mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，檢測IgA、IgG、IgM mRNA相對表達(dá)量.

表1 PCR擴(kuò)增用于的引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表征

試驗(yàn)開始當(dāng)天記為第0 d，試驗(yàn)犬灌服番瀉葉藥液第2天出現(xiàn)糞便溏稀，隨后出現(xiàn)食欲下降、毛色枯燥、消瘦以及怠倦乏力等癥狀，至第7天，有超過2/3的試驗(yàn)犬均表現(xiàn)出脾氣虛癥狀，停止給藥造模并于當(dāng)天開始給藥治療，加味四君子湯組經(jīng)治療7 d后(試驗(yàn)第14天)，上述癥狀明顯好轉(zhuǎn).

2.2 脾臟指數(shù)及脾臟Tuftsin水平的變化

造模后，脾氣虛組犬與對照組犬相比脾臟指數(shù)及脾臟Tuftsin水平均顯著降低(P<0.01).加味四君子湯治療7 d后，加味四君子湯組犬脾臟指數(shù)及脾臟Tuftsin水平有所升高，與對照組相比無差異顯著性(P>0.05)；自然恢復(fù)組犬脾臟指數(shù)及脾臟Tuftsin水平雖有升高但與對照組相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)，見表2.

表2 試驗(yàn)犬脾臟指數(shù)以及脾臟Tuftsin水平(n=6)

同列數(shù)據(jù)上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

In the same column of the different groups,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05)；different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05)；different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.3 血清中細(xì)胞因子水平的變化

造模后，與對照組相比，脾氣虛組犬血清中IFN-γ、IL-2水平極顯著降低(P<0.01)，IL-4、IL-6水平極顯著升高(P<0.01).經(jīng)加味四君子湯治療7 d后(圖1)，加味四君子湯組犬血清中IFN-γ、IL-2水平升高，IL-4、IL-6水平降低，與對照組相比無差異顯著性(P>0.05)；自然恢復(fù)組犬血清中IFN-γ、IL-2水平略升高，IL-4、IL-6水平降低，與對照組相比差異顯著(P<0.05).

2.4 脾臟病理變化

經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，脾氣虛組犬脾臟較小，色澤暗，有固縮現(xiàn)象，觸感硬有明顯的凹凸感，甚至成蜷縮卷折狀.

2.4.1 脾臟顯微結(jié)構(gòu)的變化由圖2可見，對照組(A)犬脾臟在低倍鏡下觀察，形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整、清晰，白髓和紅髓分界清楚，白髓由脾小體及動(dòng)脈周圍淋巴鞘組成，脾小體結(jié)構(gòu)完整可見中央動(dòng)脈.脾氣虛組(B)犬與對照組(A)相比，脾臟結(jié)構(gòu)不完整，紅髓髓竇擴(kuò)張、充血，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞減少，脾小體萎縮.自然恢復(fù)組(C)犬可見脾臟結(jié)構(gòu)有一定程度的恢復(fù)，紅髓和白髓可以區(qū)分，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞較脾氣虛組增多，但脾小體結(jié)構(gòu)較正常組不完整.經(jīng)加味四君子湯治療后，加味四君子湯組(D)犬的脾臟形態(tài)明顯改善，紅髓白髓分界清晰，可見小梁，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞較自然恢復(fù)組(C)增多，可見中央動(dòng)脈及動(dòng)脈周圍淋巴鞘；與對照組(A)相比基本恢復(fù)正常.

同一日齡不同處理組相比，圖柱上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same day age,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).圖1 試驗(yàn)犬血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6含量Figure 1 The concents of IFN-γ，IL-2，IL-4 and IL-6 in the serum of the experimental canines

A：對照組；B：脾氣虛組；C：自然恢復(fù)組；D：加味四君子湯組；△：紅髓；↑：中央動(dòng)脈；☆：脾小體；：動(dòng)脈周圍淋巴鞘；：髓竇；：脾索.A：Control Group；B：Spleen Deficiency Group；C：Natural Recovery Group；D：Supplementary SJZD Group；△：Red pulp；↑：Central artery；☆：Splenic nodule；：Periarterial lymphatic sheath；：Medullary sinus；：Splenic cord.圖2 試驗(yàn)犬脾臟病理學(xué)變化(HE染色，×40)Figure 2 Pathological changes in the spleen of the experimental canines

2.4.2脾臟超微結(jié)構(gòu)的變化經(jīng)透射電鏡觀察各組犬脾臟細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，對照組(A)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，胞間連接緊密，細(xì)胞器較完整，偶有空泡樣變.脾氣虛組(B)與對照組(A)相比明顯可見核膜間隙增寬，核固縮，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，線粒體脊排列紊亂、斷裂以及線粒體空泡樣病變.自然恢復(fù)組(C)核膜間隙相對脾氣虛組(B)有所減小；與對照組(A)相比可見細(xì)胞器較少，細(xì)胞間縫隙增寬，線粒體脊斷裂以及局部空泡化.加味四君子湯組(D)與對照組(A)相比無明顯差異，但仍可見部分細(xì)胞存在修復(fù)痕跡(圖3).

A：對照組；B：脾氣虛組；C：自然恢復(fù)組；D：加味四君子湯組；→：示核膜間隙.A：Control group；B：Spleen deficiency group；C：Natural recovery group；D：Supplementary SJZD group；→：perinuclear space.圖3 試驗(yàn)犬脾臟超微病理變化(×8 000)Figure 3 Ultrastructural pathological changes in the spleen of the experimental canines

2.5 小腸各段sIgA陽性表達(dá)水平的變化

IHC檢測結(jié)果如圖4所示，棕黃色區(qū)域?yàn)殛栃员磉_(dá)產(chǎn)物，經(jīng)蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核呈藍(lán)色.試驗(yàn)犬小腸各段sIgA陽性表達(dá)產(chǎn)物主要分布于粘膜上皮及固有層小腸腺內(nèi)部.圖5反映了試驗(yàn)犬小腸各段sIgA陽性表達(dá)的平均光密度值.由圖可知，試驗(yàn)犬小腸各段均有sIgA陽性表達(dá)產(chǎn)物，其中脾氣虛組犬十二指腸sIgA陽性表達(dá)量極顯著低于對照組犬(P<0.01)；自然恢復(fù)組犬十二指腸sIgA陽性表達(dá)量雖有升高但仍低于對照組犬(P<0.01)；經(jīng)加味四君子湯治療后，加味四君子湯組犬十二指腸sIgA陽性表達(dá)量明顯恢復(fù)，與對照組相比差異不顯著(P>0.05).試驗(yàn)犬空腸、回腸sIgA陽性表達(dá)量變化與十二指腸一致.

1：十二指腸；2：空腸；3：回腸；Y：陰性對照；A：對照組；B：脾氣虛組；C：自然恢復(fù)組；D：加味四君子湯組.1：Duodenum；2：Jejunum；3：Ileum；Y.Negative control；A：Control group；B：Spleen deficiency group；C：Natural recovery group；D：Supplementary SJZD group.圖4 試驗(yàn)犬小腸各段sIgA陽性表達(dá)水平(×400)Figure 4 The positive expression level of sIgA in the small intestine of the experimental canines

同一組織不同處理組相比，圖柱上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).圖5 試驗(yàn)犬小腸各段sIgA平均光密度值Figure 5 The density mean of sIgA in the small intestine of the experimental canines

2.6 小腸組織中IgA、IgG、IgM mRNA相對表達(dá)量的變化

造模后，脾氣虛組犬十二指腸IgA、IgG、IgM mRNA的相對表達(dá)量極顯著低于對照組犬(P<0.01)；自然恢復(fù)組犬十二指腸IgA、IgG、IgM mRNA的相對表達(dá)量略有回升，但是仍然顯著低于對照組犬(P<0.01)；經(jīng)加味四君子湯治療后，加味四君子湯組犬十二指腸IgA、IgG、IgM mRNA的相對表達(dá)量恢復(fù)至正常水平，與對照組相比差異不顯著(P>0.05).空腸和回腸IgA、IgG、IgM mRNA相對表達(dá)量的變化，與十二指腸變化一致(圖6).

3 討論

本試驗(yàn)在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，選用番瀉葉藥液復(fù)制脾氣虛證動(dòng)物模型，試驗(yàn)犬表現(xiàn)的臨床癥狀與中醫(yī)脾氣虛證候具有很多相似之處.糞便溏稀、食少納呆，精神不振，毛發(fā)不榮，嗜臥不喜動(dòng)等癥狀，符合中醫(yī)脾氣虛證候的特點(diǎn)，說明脾氣虛模型復(fù)制成功.本試驗(yàn)中，脾氣虛組犬多個(gè)免疫指標(biāo)相比對照組均有下降，說明脾氣虛證與機(jī)體免疫功能低下密切相關(guān).

圖6 試驗(yàn)犬小腸各段IgA、IgG、IgM mRNA的相對表達(dá)量Figure 6 The IgA，IgG and IgM mRNA realtive expression values in the small intestine of the experimental canines

3.1 加味四君子湯對脾氣虛犬脾臟形態(tài)及功能的影響

脾臟作為機(jī)體最大的免疫器官，是具有免疫活性的T細(xì)胞和B細(xì)胞移居和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所，一般認(rèn)為脾臟指數(shù)較高，說明機(jī)體免疫功能較強(qiáng)[10].脾臟主要由白髓、紅髓以及邊緣區(qū)構(gòu)成，白髓是淋巴細(xì)胞主要聚集的場所；邊緣區(qū)主要由吞噬細(xì)胞和B細(xì)胞組成，將白髓和紅髓隔開，對抗原大小、類別起到篩選和屏障作用[11-12].Tuftsin是免疫球蛋白Ig G的Fc段在脾臟降解產(chǎn)生的一種內(nèi)源性四肽，其分子量為500.59 ku，結(jié)構(gòu)為蘇-賴-脯-精氨酸(Thr-Lys-Pro-Arg,TKRP)[13-14].有研究表明Tuftsin生物活性較為廣泛，在脾臟功能受損的情況下濃度降低，是反應(yīng)脾臟免疫功能的特有因子[15-16].葉文斌等[17]用環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，模型小鼠脾臟指數(shù)以及脾淋巴細(xì)胞增值明顯降低；丁楊等[18]采用大黃灌胃復(fù)制脾虛小鼠后也發(fā)現(xiàn)脾淋巴細(xì)胞增值能力明顯降低；廖樂樂等[19]研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可以使脾虛小鼠胸腺、脾臟萎縮現(xiàn)象得到改善，并修復(fù)胸腺、脾臟結(jié)構(gòu)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖.本試驗(yàn)中，根據(jù)各組試驗(yàn)犬脾臟HE染色以及電鏡觀察結(jié)果均發(fā)現(xiàn)脾臟組織形態(tài)及淋巴細(xì)胞不同程度的改變，其中脾氣虛組犬脾臟組織形態(tài)及淋巴細(xì)胞破壞程度較對照組明顯，經(jīng)加味四君子湯治療后，可見明顯修復(fù)；脾氣虛組犬脾臟Tuftsin水平顯著降低，經(jīng)加味四君子湯治療后，Tuftsin水平升高.結(jié)果提示，脾氣虛犬脾臟組織形態(tài)發(fā)生改變并在一定程度上降低脾臟免疫機(jī)能，加味四君子湯可顯著改善脾臟組織形態(tài)以及脾臟免疫機(jī)能低下的狀態(tài).

3.2 加味四君子湯對脾氣虛犬血清細(xì)胞因子水平的影響

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有多種生物活性的小分子蛋白質(zhì).IL-2、IFN-γ主要由介導(dǎo)細(xì)胞免疫的Th1細(xì)胞產(chǎn)生；IL-4、IL-6主要由介導(dǎo)體液免疫的Th2細(xì)胞產(chǎn)生.Wang等[20]通過利血平復(fù)制大鼠脾氣虛模型后發(fā)現(xiàn)其脾臟指數(shù)、內(nèi)皮淋巴細(xì)胞上清液中IL-2、IFN-γ水平顯著下降；金鐘曄等[21]復(fù)制大鼠脾氣虛模型后發(fā)現(xiàn)，其血清中IL-6水平較正常組顯著升高；韓曉春等[22]復(fù)制大鼠水濕不化脾氣虛模型后發(fā)現(xiàn)，其血清中IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4水平升高；楊冬花等[23]復(fù)制脾氣虛大鼠模型并收集脾臟T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清中IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，Th0向Th2偏移，至Th1/Th2失衡，即“Th1/Th2漂移”現(xiàn)象；伍楊等[24]認(rèn)為Th1優(yōu)勢狀態(tài)具有免疫增強(qiáng)的作用.以上研究表明，脾氣虛證的發(fā)生常伴隨著細(xì)胞因子水平的變化，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫機(jī)能.輔助性T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起著重要作用.本試驗(yàn)中，以Th1細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ和Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6為研究對象，觀察其水平的變化.脾氣虛犬血清中IFN-γ、IL-2水平降低，IL-4、IL-6水平升高，表明Th0向Th2偏移，Th1/Th2失衡.經(jīng)加味四君子湯治療后，IFN-γ、IL-2水平回升，IL-4、IL-6水平降低，說明加味四君子湯可以有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，糾正漂移現(xiàn)象，提高機(jī)體免疫力.

3.3 加味四君子湯對脾氣虛犬腸道免疫球蛋白的影響

腸道不僅是消化吸收的重要場所，同時(shí)也是機(jī)體防御外界病原入侵的重要免疫器官.腸粘膜作為機(jī)體防止感染的第一道防線，其屏障作用就顯得尤為重要.戈娜等[25]認(rèn)為，腸道免疫防御系統(tǒng)主要由存在于腸壁的腸相關(guān)淋巴樣組織(GALT)及其分泌的免疫球蛋白A、G、M(IgA、IgG、IgM)等構(gòu)成.分泌型免疫球蛋白A(sIgA)可由2個(gè)或2個(gè)以上的免疫球蛋白A(IgA)單體通過J鏈和分泌(SC)片以共價(jià)鍵形式結(jié)合而成，是粘膜免疫的主要效應(yīng)因子[26]，其發(fā)揮主要作用的部位是局部粘膜，主要由粘膜固有層漿細(xì)胞產(chǎn)生.本試驗(yàn)中，我們采集了各組試驗(yàn)犬小腸各段(十二指腸、空腸和回腸)組織樣本，并采用IHC法檢測了小腸各段sIgA陽性表達(dá)量、RT-PCR檢測了小腸各段IgA、IgG、IgM mRNA相對表達(dá)量.試驗(yàn)結(jié)果提示，脾氣虛犬腸道粘膜的免疫機(jī)能低下，加味四君子湯可提高粘膜免疫球蛋白水平，有效改善脾氣虛癥狀.

4 結(jié)論

綜上所述，脾氣虛證與機(jī)體免疫功能低下密切相關(guān)，加味四君子湯可顯著增強(qiáng)脾氣虛犬的免疫機(jī)能.表現(xiàn)在，添加加味四君子湯后脾氣虛犬脾臟指數(shù)、脾臟Tuftsin水平顯著升高，糾正了Th1/Th2細(xì)胞因子水平失衡，改善了脾臟組織及細(xì)胞病變，同時(shí)也提高了腸道免疫球蛋白表達(dá)水平.其治療機(jī)制可能是加味四君子湯修復(fù)了受損的脾臟以及腸道粘膜，能夠使其發(fā)揮免疫功能，從而提高機(jī)體免疫功能.