張玉寧，史宏志，王 景，周 炎，楊惠娟

河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院 國家煙草栽培生理生化基地，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63號 450002

氮素是植物生長過程中所必需的大量元素之一，對煙草的生長以及煙葉品質(zhì)形成有重要作用［1-3］。根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，氮素營養(yǎng)對根系生長有較大影響［4］。硝態(tài)氮不僅是植物生長所需的主要氮源，作為信號分子對植物生長發(fā)育也有重要影響［5］。硝酸根信號的傳導是通過植物根系，不同濃度的硝酸根信號會引起根系基因表達的變化，研究不同氮營養(yǎng)條件下煙草根系基因表達的差異能夠闡明煙草根系對硝態(tài)氮信號響應的相關(guān)分子機制。有研究表明，硝酸根作為信號分子對植物磷酸戊糖氧化、糖酵解、氨基酸代謝等多種重要的生理途徑有重要作用，對相關(guān)基因也有重要的誘導和調(diào)控作用［5-7］。硝酸根信號對植物體其他生長發(fā)育相關(guān)代謝途徑的基因也有重要調(diào)節(jié)作用，其中硝酸還原酶基因和亞硝酸還原酶基因是典型的受硝酸根調(diào)節(jié)基因。已有研究表明，一些參與硝酸根信號響應調(diào)控途徑的基因或轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥中的ANR1，在NO3-充足條件下可以促進側(cè)根的生長［8-10］。但烤煙根系對外界硝酸根信號的分子響應機制尚不明確，尤其是不同濃度硝酸根營養(yǎng)條件下烤煙根系的差異表達基因亟待研究。為此，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對煙草根系響應不同濃度硝態(tài)氮營養(yǎng)的差異表達基因進行分析，旨在為明確植物硝酸根信號轉(zhuǎn)導過程以及烤煙氮素營養(yǎng)的代謝機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以烤煙品種K326 為試驗材料，采用漂浮育苗技術(shù)培育煙苗，煙苗長至3～4 片真葉時移栽，取生長狀況一致的健壯煙苗移植于水槽中，放置于光照培養(yǎng)架上，用MS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。試驗在溫濕度可控制的溫室中進行，培養(yǎng)條件為14 h 光照，10 h 黑暗，溫度28 ℃左右，相對濕度在65%～75%，每3 d更換1 次營養(yǎng)液，待煙苗長至6～8 片葉時進行處理。設置高濃度氮營養(yǎng)處理組（硝酸根濃度為5.0 mmol/L）、低濃度氮營養(yǎng)處理組（硝酸根濃度為0.1 mmol/L）及正常氮營養(yǎng)處理組，用氯化鉀調(diào)節(jié)鉀營養(yǎng)濃度一致。取正常氮營養(yǎng)濃度培養(yǎng)的煙草根系樣品（CK，0 h），高氮營養(yǎng)處理后分別于6、12 和 24 h 取 3～5 株煙苗根系樣品（H.6、H.12 和H.24），低氮營養(yǎng)處理后分別于 6、12 和 24 h 取 3～5 株煙苗根系樣品（L.6、L.12 和L.24），迅速清洗后混勻放入液氮中速凍，并保存于-80 ℃冰箱中。設置3 次生物學重復。

1.2 RNA提取與建庫測序

將樣品送至武漢菲莎基因信息有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。用CTAB 法進行樣品總RNA 的提取，選擇質(zhì)量適宜的總RNA 作為mRNA 建庫起始樣品；用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，接著配制mRNA 片段化反應體系將其片段化至目標長度范圍；以打斷后的mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成第一鏈cDNA，再配制第二鏈合成反應體系合成第二鏈cDNA；純化后進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭；進行片段大小選擇，然后進行PCR 擴增。擴增體系50 μL，包括：20 μ L cDNA，3 μ L USER 酶，25 μ L High-Fidely PCR 預混液，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物。擴增條件：98 ℃預變性 30 s；98 ℃變性 10 s、65 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 12 個循環(huán)；72 ℃ 5min，4 ℃保存。將PCR 產(chǎn)物進行純化得到最終文庫，構(gòu)建的文庫質(zhì)檢合格后進行測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始的未經(jīng)過濾的測序序列（Reads），然后對原始的未經(jīng)過濾測序序列進行質(zhì)控（QC）過濾，再對過濾后測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，以確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)的生物信息學分析。

1.3 差異表達基因的篩選

基因差異表達分析的輸入數(shù)據(jù)為基因表達水平分析中得到的數(shù)據(jù)，用R 語言包edgeR 進行差異分 析［11］，篩 選 閾 值 為 FDR ＜0.05，log2FC ＞1 或log2FC＜-1。

1.4 生物信息學分析

通過Cluster 軟件對基因表達模式進行聚類分析，從整體上直觀反映多個樣本中相同基因的表達模式?；诰垲惙治鼋Y(jié)果，根據(jù)基因表達情況將差異表達基因進一步劃分為Sub-cluster 亞群，并進行代謝通路（Pathway）富集分析。KEGG 是有關(guān)代謝通路的主要公共數(shù)據(jù)庫，代謝通路顯著性富集分析以KEGG Pathway 為單位，應用超幾何檢驗，找出差異基因相對于所有注釋基因顯著富集的代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制與評估

利用高通量測序技術(shù)，對高、低兩種硝酸根濃度處理后不同時間點獲得的21 個樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估結(jié)果見表1。經(jīng)篩選過濾后，共得到669 810 979 條測序序列（Clean reads），堿基錯誤率均小于0.03%，Q30 均大于 85.00%。說明本試驗中的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好、準確度高，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的需要。

表1 RNA-seq 數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.1 Overview of RNA-seq data

2.2 高、低氮濃度營養(yǎng)條件下煙草根部基因表達的聚類分析

通過Cluster 軟件對基因表達進行聚類分析結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，與對照組相比，部分基因的表達隨時間的推移無明顯變化，包括持續(xù)高表達基因（紅色區(qū)域）、持續(xù)低表達基因（藍色基因）和差異表達基因。對差異表達基因進一步進行亞群分析（圖2）表明，高氮營養(yǎng)條件下差異表達基因分為 4 個 Sub-cluster 亞群。Sub-cluster 1 亞群基因表達量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在處理6 h和12 h 時表達量持續(xù)降低，處理24 h 時表達量略微升高。Sub-cluster 2 和Sub-cluster 4 亞群基因在處理后6 h 時表達量顯著上升，處理12 h 時表達量有所降低，處理24 h 時表達量又有所上升。Sub-cluster 3 亞群基因與對照組相比表達量緩慢上升。

低氮營養(yǎng)條件下差異表達基因分為3 個Sub-cluster 亞群。Sub-cluster 5 亞群基因在處理0～24 h 時表達量僅有略微變化，個別基因在處理6 h 和12 h 時表達量有所升高但隨后又下降，整體呈現(xiàn)略微上升趨勢。Sub-cluster 6 亞群基因表達量先急劇下降，之后又上升，在處理12 h 時表達量達到最低，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。Sub-cluster 7亞群基因在處理6 h 時表達量最高，隨后逐漸降低，在處理24 h 時表達量略高于處理前水平。

2.3 不同氮水平營養(yǎng)條件下煙草根部差異表達基因亞群的KEGG分析

2.3.1 高氮條件下差異表達基因亞群的KEGG分析

高氮營養(yǎng)條件下差異表達基因的不同亞群KEGG 代謝通路分析結(jié)果見表2。其中Sub-cluster 1 亞群中基因主要集中在戊糖和葡萄糖（醛酸轉(zhuǎn)化、玉米素生物合成、煙酸和煙酰胺代謝等代謝通路中。

圖1 高、低氮水平營養(yǎng)條件下煙草根部基因表達模式Fig.1 Gene expression profiles of tobacco roots at high and low levels of nitrate nitrogen

圖2 高低氮營養(yǎng)水平下煙草根部差異表達基因的亞群分類Fig.2 Sub-clusters of differentially expressed genes in tobacco roots at high and low levels of nitrate nitrogen

表2 高氮水平營養(yǎng)條件下基因顯著富集的部分代謝通路條目Tab.2 Partial KEGG pathways of differentially expressed genes at high level of nitrate nitrogen

Sub-cluster 2 與Sub-cluster 4 亞群中基因的表達模式類似，均在處理6 h 時基因表達量顯著提高，處理12 h 時有所降低，處理24 h 時表達量又上升。Sub-cluster 2 亞群中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑的丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合成酶基因表達量顯著上調(diào)，以及?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑的半胱胺雙加氧酶、谷氨酸脫羧酶兩個基因的表達量也顯著上調(diào)。生物素代謝途徑和脂肪酸生物合成途徑的 FabF、FabG、FabZ 和FabI 4 個酶基因，托品烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成途徑的腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達量上調(diào)。另外，多個涉及氨基酸合成途徑的關(guān)鍵酶基因表達量也呈顯著上調(diào)模式，如精氨酸生物合成和脯氨酸代謝途徑中的精氨酸酶基因，苯丙氨酸代謝途徑中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，丙酮酸代謝途徑中的丙酮酸激酶基因，賴氨酸生物合成途徑中的反-肉桂酸-4-單加氧酶、莽草酸-O-羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶、阿魏酰-5-羥基化酶和咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶等基因，以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑中的谷氨酸脫氫酶基因。Sub-cluster 4 亞群中涉及核糖體途徑的較多基因表達量上調(diào)，苯丙素生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成以及二苯乙烯類和姜酚生物合成等途徑中的少量基因表達量也上調(diào)。

Sub-cluster 3 亞群中基因的表達量呈緩慢上升趨勢。嘌呤代謝途徑和嘧啶代謝途徑中核苷二磷酸激酶等基因表達量均上調(diào)；植物激素信號轉(zhuǎn)導，果糖和甘露糖代謝，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等其他代謝途徑中基因表達量也均有上調(diào)。

2.3.2 低氮條件下差異表達基因亞群的KEGG分析

低氮營養(yǎng)條件下差異表達基因的亞群分析結(jié)果（表3）顯示：Sub-cluster 6 和Sub-cluster 7 亞群中基因表達量變化顯著；Sub-cluster 6 亞群中的基因表達量呈先下降后上升的趨勢，在處理12 h 時表達量最低。發(fā)生變化的基因為生物素代謝和脂肪酸生物合成途徑中的FabF、FabG、FabZ 和FabI 4個酶基因；與組氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等合成相關(guān)的基因如乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、莽草酸脫氫酶和酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因等；嘌呤代謝和嘧啶代謝中的核苷二磷酸激酶、5'-核苷酸酶基因；托品烷、哌啶和吡啶生物堿合成途徑中的腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶、伯胺氧化酶基因等。另外，還包括淀粉和蔗糖代謝途徑中的己糖激酶和果糖激酶基因等。

Sub-cluster 7 亞群中的基因表達量呈先上升后下降趨勢，在處理后6 h 時表達量最高，隨后逐漸降低。其中，核糖體中多個核糖體蛋白基因，苯丙素生物合成中的咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和阿魏酰-5-羥基化酶基因，氨基酸合成途徑中的谷氨酸脫氫酶、天冬酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫羧酶基因，以及氮代謝途徑中的硝酸還原酶基因等表達量均上調(diào)。

表3 低氮水平營養(yǎng)條件下差異基因顯著富集的部分代謝通路條目Tab.3 Partial KEGG pathways of differentially expressed genes at low level of nitrate nitrogen

2.3.3 高、低氮營養(yǎng)條件下KEGG 代謝途徑的比對分析

表4 表明，在高氮、低氮營養(yǎng)條件下處理6 h時一些基因表達量均顯著上調(diào)，主要集中在核糖體、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝等9 個代謝途徑中。如苯丙素生物合成中的咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、阿魏酰-5-羥基化酶基因，多種氨基酸合成與代謝途徑中的谷氨酸脫氫酶、天冬酰胺合成酶、琥珀酸半醛脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸激酶、脯氨酰4-羥化酶、脯氨酸脫氫酶等多個基因表達量均在處理6 h 時表達量最高。

低氮營養(yǎng)條件處理6 h 時一些基因表達量顯著下降，而高氮營養(yǎng)條件下處理6 h 時表達量則顯著上升，表達模式截然相反。這些基因主要集中在生物素代謝，托品烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，嘧啶與嘌呤代謝，蔗糖和淀粉代謝，脂肪酸代謝等途徑。這表明在低氮營養(yǎng)條件下這些代謝受到一定程度的抑制。

表4 兩種氮水平營養(yǎng)條件下差異表達基因顯著富集的相同代謝通路條目Tab.4 Same KEGG pathways of differentially expressed genes at high and low levels of nitrate nitrogen

3 討論

本研究中對高、低氮營養(yǎng)條件下煙草根系的轉(zhuǎn)錄組進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間的延長表達模式相似的基因聚成一類。通過KEGG 代謝途徑的生物信息學分析，兩種氮營養(yǎng)條件下差異基因主要集中在苯丙素生物合成等途徑中。這與前人對谷子［12］、燈盞花［13］低氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致，說明大量相關(guān)調(diào)控基因參與碳氮代謝等一些次級代謝途徑進而影響烤煙的生長發(fā)育。但對高氮脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組分析較少，尚需進一步研究。

集中在核糖體、苯丙素生物合成以及多種氨基酸合成與代謝等途徑中的差異表達基因的表達量均為處理6 h 時顯著升高?？Х人?-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、阿魏酰-5-羥基化酶基因是木質(zhì)素生物合成過程的關(guān)鍵基因［14］，而木質(zhì)素在植物抵御外界脅迫中發(fā)揮重要作用［15］。本研究中這兩種酶在苯丙素生物合成途徑中表達量上調(diào)可能與此有關(guān)。多種氨基酸合成與代謝途徑中的谷氨酸脫氫酶基因表達量上調(diào)可能是由于谷氨酸脫氫酶在植物逆境脅迫中體內(nèi)碳氮代謝調(diào)控上發(fā)揮重要作用引起的［16-18］。谷氨酸脫羧酶能調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的碳氮平衡、參與調(diào)節(jié)植株與逆境脅迫相關(guān)的基因表達［19］，本研究中谷氨酸脫羧酶基因表達上調(diào)可能也與此有關(guān)。天冬酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶等基因表達也上調(diào)，這可能與天冬酰胺合成酶在調(diào)控氮代謝和氮的庫源關(guān)系中發(fā)揮作用［20］，谷氨酰胺合成酶提高植株耐氮脅迫能力有關(guān)［21］。

生物素代謝等途徑中的差異表達基因在高氮營養(yǎng)條件下處理6 h 時表達量顯著上調(diào)，低氮條件下則與之相反；但發(fā)生變化的基因相同，說明氮素的不足會抑制烤煙根系生物堿的合成與能量代謝，而氮素過量則起到促進作用。托品烷、哌啶和吡啶生物堿中的腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶是合成煙堿的關(guān)鍵酶［22-23］，而煙堿對煙葉品質(zhì)有重要影響［24］。本研究中差異表達基因集中的代謝途徑中與碳代謝相關(guān)的途徑較多，說明氮營養(yǎng)水平的變化對碳代謝影響較大。氨基酸生物合成及代謝途徑中的基因也發(fā)生變化，說明這些途徑的代謝活動在抵抗氮脅迫過程中發(fā)揮作用，并參與植物體內(nèi)氮代謝途徑及碳氮平衡的調(diào)節(jié)［25］。可見，高、低氮營養(yǎng)條件下可能有相同的硝酸根信號轉(zhuǎn)導途徑，只是在碳氮代謝等次級代謝及與煙草生長相關(guān)途徑響應脅迫后機體發(fā)生的變化不同。而有關(guān)高、低硝態(tài)氮營養(yǎng)條件下硝酸信號轉(zhuǎn)導的共同途徑以及氮信號途徑中起主要調(diào)控作用的基因仍需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

在溫室（14 h 光照，10 h 黑暗，溫度 28 ℃，相對濕度65%～75%）條件下進行了烤煙品種K326煙苗培育及高濃度硝態(tài)氮與低濃度硝態(tài)氮營養(yǎng)脅迫處理試驗。結(jié)果表明：高氮和低氮營養(yǎng)條件下Sub-cluster 亞群中的一些基因表達量先上調(diào)之后又下降，這些基因主要涉及苯丙素生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等途徑。氨基酸、碳氮代謝途徑是響應不同氮營養(yǎng)條件的重要代謝途徑，低濃度氮營養(yǎng)可抑制烤煙根部托品烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，嘧啶和嘌呤代謝，果糖和甘露糖代謝，淀粉和蔗糖代謝等多條途徑關(guān)鍵基因的表達，而高濃度氮營養(yǎng)則促進其基因表達。