林蕓蕓，黃珊，宋艷玲，顧申紅#

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海口570102；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，?？?570102）

缺血性心血管疾病是世界范圍內(nèi)患者死亡的首要原因，急性心肌缺血性損傷可導(dǎo)致患者冠狀動(dòng)脈長(zhǎng)期供血不足，從而致使其心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷[1］。有研究指出，急性心肌梗死患者常常合并內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）減少及功能下降[2］。EPCs是一類(lèi)在血液系統(tǒng)中循環(huán)并能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，其數(shù)量減少是血管內(nèi)皮功能紊亂的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3］。相關(guān)研究表明，阿托伐他汀可升高冠心病患者體內(nèi)高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，后者是EPCs數(shù)量和功能的重要決定因素[3-4］。同時(shí)，由EPCs分泌的微囊泡（MVs）可抑制心肌細(xì)胞肥大和凋亡，并促進(jìn)受損心肌細(xì)胞恢復(fù)[4-5］。近年來(lái)有研究證實(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡（EPC-MVs）可介導(dǎo)重要的生物學(xué)調(diào)控功能（如血管的修復(fù)與再生、相關(guān)細(xì)胞內(nèi)皮化等），而人源微RNA-126（hsa-miR-126）作為EPCs特異性表達(dá)的一種促血管內(nèi)皮新生的微RNA（miRNA），極有可能參與了上述生物學(xué)調(diào)控的過(guò)程[6］。本研究通過(guò)觀察阿托伐他汀對(duì)ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者EPCs數(shù)目以及MVs分泌功能的影響，以期為進(jìn)一步明確他汀類(lèi)藥物的作用機(jī)制，為急性心肌缺血性損傷的防治提供有效治療策略。

1 資料與方法

1.1 納入、排除與脫落標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):（1）依據(jù)《2012年歐洲心臟病學(xué)會(huì)ST段抬高的急性心肌梗死管理指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7］確診為STEMI；（2）年齡 45～75歲；（3）從未使用過(guò)他汀類(lèi)藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn):（1）惡性腫瘤患者；（2）嚴(yán)重的內(nèi)科疾病患者；（3）嚴(yán)重的肝、腎、肺功能不全者；（4）慢性傳染性疾病患者；（5）精神疾病患者；（6）存在藥物過(guò)敏史者；（7）服藥依從性差者；（8）孕產(chǎn)婦；（9）出現(xiàn)肌酸磷酸激酶升高（＞7.5 U/dL）并伴有肌炎者[8］。

脫落標(biāo)準(zhǔn):（1）失去聯(lián)系無(wú)法獲得長(zhǎng)期隨訪信息者；（2）不配合隨訪調(diào)查，語(yǔ)言表達(dá)不明確者；（3）死亡者。

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)后，所有受試者均知曉本研究的內(nèi)容及目的，并簽署了知情同意書(shū)，嚴(yán)格遵照同意書(shū)精神進(jìn)行本項(xiàng)研究。

1.2 研究對(duì)象

選取2015年2月－2018年2月我院心內(nèi)科收治的STEMI患者182例，按照所服用阿托伐他汀的劑量分為A組（88例）和B組（94例）。

其中，A組中男性50例，女性38例；年齡52～75歲，平均（61.3±8.1）歲；有吸煙史者39例（占44.32%）；高血壓18例（占20.45%），高脂血癥31例（占35.22%），糖尿病12例（占13.64%），糖尿病合并高血壓18例（占20.45%），糖尿病合并高脂血癥5例（占5.68%），高血壓合并糖尿病3例（占3.41%），高血壓合并糖尿病、高脂血癥者1例（占1.14%）。B組中男性53例，女性41例；年齡50～75歲，平均（61.3±8.1）歲；有吸煙史者38例（占40.43%）；高血壓18例（占19.15%），高脂血癥28例（占29.79%），糖尿病20例（占21.28%），糖尿病合并高血壓21例（占22.34%），高血壓合并糖尿病與高脂血癥者7例（占7.45%）。兩組患者上述一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影分析，兩組患者的冠狀動(dòng)脈血管病變數(shù)目、病變位置及病變類(lèi)型等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，詳見(jiàn)表1（同一患者可能存在多處病變或多種病變類(lèi)型，故其合計(jì)值＞患者總數(shù)）。

表1 兩組患者冠狀動(dòng)脈病變情況比較[例（%%）］Tab 1 Comparison of coronary artery lesion between 2 groups[case（%%）］

1.3 治療方法

兩組患者均接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI），術(shù)后予注射用比伐蘆定[江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20140057，規(guī)格:0.25 g（按C98H138N24O33計(jì)）］0.75 mg/kg，靜脈注射，隨后以1.75 mg/（kg·h）靜脈滴注至術(shù)后6 h，同時(shí)口服硫酸氫氯吡格雷片（法國(guó)Sanofi Clir SNC公司，注冊(cè)證號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字J20130083，規(guī)格:75 mg），維持劑量為75 mg/d，每日1次+阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408，規(guī)格:20 mg）行抗血小板治療。其中，A組患者口服20 mg，每日1次；B組患者口服20 mg，每日2次。30 d為1個(gè)療程，兩組患者均連續(xù)治療至少3個(gè)療程。

1.4 考察指標(biāo)

1.4.1 血脂水平的檢測(cè) 分別于治療前及治療后第30、60、90天自前臂靜脈抽取兩組患者的外周靜脈血2 mL，采用化學(xué)抽提法以VITROS 5600型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑盒（美國(guó)Johnson&Johnson公司）檢測(cè)血液中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、HDLC的水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.2 EPCs的檢測(cè) 分別于治療后第30、60天，自前臂靜脈抽取兩組患者的外周靜脈血20 mL，置于含3.8%肝素鈉的真空采血管中，于4℃下以1 600 r/min離心30 min，分離外周血單核細(xì)胞。將上述單核細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，于4℃下孵育30 min后，在避光條件下分別加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的山羊抗小鼠CD133、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔CD34單克隆抗體（德國(guó)Miltenyi Biotec Macs公司，加入量均為1∶800），于4℃、2%多聚甲醛溶液中孵育30 min，用PBS清洗，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀用PBS 400 μL重懸后，采用EPICS?XL-MCLTM流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)，并記錄EPCs陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（CD133、CD34雙染色即為EPCs陽(yáng)性細(xì)胞）。

1.4.3 EPC-MVs的提取及其miRNA表達(dá)譜的檢測(cè) 于治療后第60天，取“1.4.2”項(xiàng)下EPCs約1×106個(gè)，加至含0.5%胎牛血清白蛋白（BSA）的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，于4℃下以2 500 r/min離心20 min，收集上清液，繼續(xù)于4℃下以10 000 r/min離心1 h，棄去上清液，沉淀用含25 mmo/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（pH 7.3）的Medium 199培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）進(jìn)行重懸，于4℃下以10 000 r/min離心1 h，沉淀用PBS 100 μL重懸，于－80℃冰箱中保存，備用。采用Affymetrix microRNA 3.0 Array基因芯片檢測(cè)兩組患者經(jīng)阿托伐他汀治療后外周血EPC-MVs miRNA的表達(dá)譜。該試驗(yàn)操作及結(jié)果判定均由上海其明信息技術(shù)有限公司完成。

1.4.4 差異miRNA表達(dá)的驗(yàn)證 根據(jù)“1.4.3”項(xiàng)下表達(dá)譜的檢測(cè)結(jié)果，選擇5個(gè)差異較大（兩組患者每個(gè)特異性芯片富集miRNA的reads數(shù)的差異倍數(shù)大于1為“上調(diào)”，其值越大，差異越明顯；差異倍數(shù)小于1為“下調(diào)”，其值越小，差異越明顯）的基因，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（qRT-PCR）對(duì)其miRNA表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。取“1.4.2”項(xiàng)下EPCs約1×106個(gè)，采用Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）并參照其說(shuō)明書(shū)方法提取細(xì)胞總RNA，采用miRNA首鏈cDNA合成試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）并參照其說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄得miRNA，以U6為內(nèi)參，采用qRT-PCR法檢測(cè)miRNA的表達(dá)量。反應(yīng)體系及條件參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本Takara公司）說(shuō)明書(shū)，采用2－ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量（Ct表示每個(gè)樣品的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）[9］。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4.5 差異表達(dá)最明顯的miRNA靶基因分析 通過(guò)StarBase在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://starbase.sysu.edu.cn/）檢索差異表達(dá)最明顯（即miRNA表達(dá)差異倍數(shù)最大）的靶基因，并通過(guò)DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)其進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.4.6 差異表達(dá)最明顯的miRNA對(duì)心肌HCM-a細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8法檢測(cè)差異表達(dá)最明顯miRNA對(duì)心肌HCM-a細(xì)胞的影響。該miRNA特異性干擾物（siRNA）、模擬物（mimics）和陰性對(duì)照物（NC）均由北京歐林格生物技術(shù)有限公司合成，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipo-fectamine 2000（美國(guó)Invitrigen公司）。取心肌HCM-a細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司）適量，接種至6孔板中，待細(xì)胞融合至60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、NC組、siRNA組和mimics組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在轉(zhuǎn)染前，先將siRNA、mimics、NC和轉(zhuǎn)染試劑分別加至OPTIMEMⅠ無(wú)血清培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）100 μL中，室溫孵育5 min后，將含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基（100 μL）分別與含siRNA、mimics、NC的培養(yǎng)基（100 μL）混合（1∶1，V/V），使siRNA、mimics、NC終濃度均為1×10－7mol/L，即得相應(yīng)轉(zhuǎn)染混合液。室溫孵育20 min后，將上述轉(zhuǎn)染混合液轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組別的心肌HCM-a細(xì)胞中，并加入含10%BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基，下同）1.8 mL（終體積為2 mL），空白組不作處理。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)轉(zhuǎn)染12 h，收集細(xì)胞，用胰蛋白酶（美國(guó)Solarbio公司）2 mL消化，隨后加入完全培養(yǎng)基配制單細(xì)胞懸液，取一部分以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“1.4.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果；取另一部分以5 000個(gè)/孔接種于至96孔板中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，按照CCK-8試劑盒（日本DojinDo公司）說(shuō)明書(shū)步驟處理48 h后，以SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值（OD值越高，表示增殖能力越強(qiáng)）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 安全性評(píng)價(jià)

記錄兩組患者治療過(guò)程中不良反應(yīng)的發(fā)生情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率檢驗(yàn)；計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用LSD-t或重復(fù)測(cè)定方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫落情況

A組有8例患者脫落，B組有6例患者脫落，脫落原因均為失聯(lián)，總體脫落率為7.69%。最終有168例患者完成本研究，其中A組80例、B組88例。

2.2 兩組患者血脂水平比較

治療前，兩組患者TC、LDL-C、HDL-C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后第60、90天，兩組患者的HDL-C水平均顯著增高，且B組顯著高于同時(shí)間點(diǎn)A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而治療前后兩組患者TC、LDL-C水平，治療后第30天HDL-C水平組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前后血脂水平比較（x±s，mmol/L）Tab 2 Comparison of blood lipid levels between 2 groups before and after treatment（x±s，mmol/L）

2.3 兩組患者外周血EPCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

治療后第30天，兩組患者外周血EPCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后第60天，B組患者外周血EPCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，且顯著多于同時(shí)間點(diǎn)A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而A組患者外周血EPCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與治療后第30天比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 兩組患者外周血EPCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（x±s，個(gè)）Tab 3 Comparison of the number of EPCs positive cells in peripheral blood between 2 groups（x±s，case）

2.4 EPC-MVs中差異表達(dá)的miRNA

與A組比較，B組患者EPC-MVs中表達(dá)差異超過(guò)1.5倍（兩組患者reads數(shù)的比值，包括增加和減小）的miRNA共有16個(gè)，其中包括7個(gè)上調(diào)表達(dá)miRNA（hsamiR-1228-5p、hsa-miR-126、hsa-miR-1275、hsa-miR-3176、hsa-miR-4521、hsa-miR-544b、hsa-miR-7974），9個(gè)下調(diào)表達(dá) miRNA（hsa-let-7b-3p、hsa-miR-105-5p、hsamiR-122-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-3180、hsa-miR-375、hsa-miR-494-5p、hsa-miR-7641、hsa-miR-7704），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，差異表達(dá)最明顯的是hsa-miR-126，B組是A組的20.91倍，詳見(jiàn)表4（表中結(jié)果表示每個(gè)特異性芯片富集miRNA的reads數(shù)）。

由表4可見(jiàn)，差異表達(dá)排前5位的分別為hsa-miR-126（上調(diào)）、hsa-miR-1275（上調(diào)）、hsa-miR-7704（下調(diào)）、hsa-miR-105-5p（下調(diào)）、hsa-miR-3180（下調(diào)），其qRTPCR引物序列見(jiàn)表5，qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，B組患者h(yuǎn)sa-miR-126、hsa-miR-1275的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，hsa-miR-7704、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3180的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。

表4 兩組患者EPC-MVs中miRNAs表達(dá)譜的檢測(cè)結(jié)果（x±s）Tab 4 Results of expression profile of miRNAs in EPC-MVs in 2 groups（x±s）

表5 qRT-PCR引物序列Tab 5 qRT-PCR primer sequences

表6 兩組患者EPC-MVs中差異表達(dá)排前5位的miRNAs的相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Tab 6 Comparison of relative expression of top 5 differentially expressed miRNAs in EPC-MVs between 2 groups（x±s）

2.5 表達(dá)差異最明顯miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及KEGG通路富集分析

由“2.4”項(xiàng)下結(jié)果可知，兩組患者h(yuǎn)sa-miR-126表達(dá)差異最為明顯，其靶基因預(yù)測(cè)與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，hsa-miR-126的靶基因包括Ang-1、PDGF、p38MAPK、Smad2/3、HIF-1、TGF-β等，參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路主要包括血管生成信號(hào)通路、慢性骨髓性白血病相關(guān)通路、腎上皮細(xì)胞癌相關(guān)通路、Wnt信號(hào)通路以及ErbB信號(hào)通路，詳見(jiàn)表7。

2.6 hsa-miR-126對(duì)心肌HCM-a細(xì)胞增殖的影響

利用hsa-miR-126的siRNA、mimics（引物序列見(jiàn)表8；其中，mimics為雙鏈結(jié)構(gòu)，有上、下游兩個(gè)引物）分別轉(zhuǎn)染成人心肌HCM-a細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后，與空白組比較，siRNA組細(xì)胞miRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，mimics組細(xì)胞miRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而NC組細(xì)胞miRNA的相對(duì)表達(dá)量與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，siRNA組細(xì)胞的OD值顯著降低，mimics組細(xì)胞的OD值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而NC組細(xì)胞的OD值與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表9。

表7 hsa-miR-126靶基因及KEGG通路富集分析結(jié)果Tab 7 Analysis results of target gene and KEGG pathway enrichment of hsa-miR-126

表8 hsa-miR-126及其siRNA、mimics引物序列Tab 8 Primer sequences of hsa-miR-126 and its si-RNAand mimics

表9 hsa-miR-126的轉(zhuǎn)染及CCK-8試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n＝3）Tab 9 Results of hsa-miR-126 transfection and CCK-8 test（x±s，n＝3）

2.7 兩組患者治療前后不良反應(yīng)發(fā)生情況

兩組患者主要的不良反應(yīng)為腹瀉、惡心嘔吐、皮疹、血脂異常和轉(zhuǎn)氨酶輕度升高等。兩組患者各不良反應(yīng)的發(fā)生率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表10。

表10 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率比較[例（%%）］Tab 10 Comparison of the incidence of ADR between 2 groups[case（%%）］

3 討論

冠心病是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起的血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟疾病[10］。血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是其常見(jiàn)的病理基礎(chǔ)之一[11］。EPCs是血管內(nèi)皮修復(fù)的主要執(zhí)行者，在此修復(fù)過(guò)程中，其可分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)新血管再生，加速血管內(nèi)皮化，并保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷或恢復(fù)受損心肌細(xì)胞的活力[7，12］。EPCs是體現(xiàn)血管內(nèi)皮功能狀態(tài)及健康程度的生物標(biāo)志物，其數(shù)量的減少被認(rèn)為與不良心血管事件、支架內(nèi)新生內(nèi)膜不良增生及血管內(nèi)皮功能障礙等有關(guān)[7，13-14］。由此可見(jiàn)，探討急性STEMI患者PCI術(shù)后長(zhǎng)期服用阿托伐他汀對(duì)體內(nèi)EPCs的增殖及MVs分泌功能的影響是研究如何有效保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷的重要途徑之一[7］。

他汀類(lèi)藥物是臨床常用藥物，可顯著降升高HDL-C水平，而后者是EPCs數(shù)量和功能的重要決定因素之一[3］。此外有研究指出，他汀類(lèi)藥物可通過(guò)誘導(dǎo)EPCs的分化來(lái)促進(jìn)動(dòng)物缺血心肌細(xì)胞的恢復(fù)[15-16］。為此，本研究探討了不同劑量阿托伐他汀對(duì)STEMI患者血脂水平和ECPs數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，在接受阿托伐他汀治療后第60、90天，兩組患者HDL-C水平均較治療前顯著升高，且B組顯著高于同時(shí)間點(diǎn)A組；治療后第60天，B組患者外周血EPCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較同組治療后第30天顯著升高，且顯著多于同時(shí)間點(diǎn)A組。這提示不同劑量的阿托伐他汀均可明顯提高患者體內(nèi)HDL-C水平，且大劑量阿托伐他汀可有助于提高患者外周血中EPCs的數(shù)量。但本研究并未發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對(duì)TC、LDL-C水平的影響，可能與本研究樣本量較小、研究時(shí)間較短等因素有關(guān)。

血漿miRNAs的穩(wěn)定性、組織特異性以及其在疾病狀態(tài)下的差異表達(dá)使其有可能成為新的生物學(xué)標(biāo)記物[17］。在心血管研究領(lǐng)域，越來(lái)越多的miRNAs被證實(shí)與急性心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7，18］。同時(shí)有研究指出，MVs可抑制心肌細(xì)胞肥大和凋亡，并促進(jìn)受損心肌細(xì)胞恢復(fù)；EPC-MVs可介導(dǎo)血管修復(fù)與再生、細(xì)胞內(nèi)皮化等生物學(xué)調(diào)控過(guò)程，而hsa-miR可能參與了上述過(guò)程[4-6］。為此，本研究借助基因芯片技術(shù)對(duì)兩組患者miRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和分析。芯片結(jié)果顯示，與A組比較，B組患者EPC-MVs中表達(dá)差異超過(guò)1.5倍的miRNA共有16個(gè)，包括7個(gè)上調(diào)、9個(gè)下調(diào)表達(dá)miRNA，其中表達(dá)差異前5位的分別為hsa-miR-126（上調(diào)）、hsa-miR-1275（上調(diào)）、hsa-miR-7704（下調(diào)）、hsa-miR-105-5p（下調(diào)）、hsa-miR-3180（下調(diào)）。qRT-PCR結(jié)果顯示，B組患者h(yuǎn)sa-miR-126、hsa-miR-1275的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，hsa-miR-7704、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3180的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，與基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致。

在這5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs中，hsa-miR-126的表達(dá)差異最明顯（B組是A組的20.91倍）。hsa-miR-126是來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞的miRNA[19］。有研究指出，冠心病患者血漿hsa-miR-126的表達(dá)水平有所降低，且該表達(dá)水平與心力衰竭患者的年齡和紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)呈負(fù)相關(guān)[18］，表明hsa-miR-126表達(dá)的下調(diào)可作為心血管疾病患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20］。本研究對(duì)hsamiR-126的靶基因及KEGG富集通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，并借助CCK-8試驗(yàn)評(píng)價(jià)了其對(duì)心肌HCM-a細(xì)胞增殖的影響。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，hsa-miR-126參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路主要包括血管生成信號(hào)通路、慢性骨髓性白血病相關(guān)通路、腎上皮細(xì)胞癌相關(guān)通路、Wnt信號(hào)通路以及ErbB信號(hào)通路等，靶基因涉及Ang-1、PDGF、p38MAPK、Smad2/3等。qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染后，siRNA組細(xì)胞miRNA的相對(duì)表達(dá)量較空白組顯著降低，mimics組細(xì)胞miRNA的相對(duì)表達(dá)量較空白組顯著升高，提示轉(zhuǎn)染改變了hsa-miR-126的表達(dá)。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA組細(xì)胞的OD值顯著降低，mimics組細(xì)胞的OD值顯著升高，提示hsa-miR-126對(duì)心肌HCM-a細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用。

安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，在治療過(guò)程中，兩組患者腹瀉、惡心嘔吐、皮疹、血脂異常和轉(zhuǎn)氨酶輕度升高的發(fā)生率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示增加阿托伐他汀的劑量并不會(huì)對(duì)其安全性造成影響。

綜上所述，不同劑量的阿托伐他汀均可調(diào)節(jié)患者體內(nèi)HDL-C水平，大劑量阿托伐他汀可顯著提高EPCs的數(shù)量，且不會(huì)影響用藥的安全性。兩組患者EPC-MVs中的差異表達(dá)miRNA共有16個(gè)，其中7個(gè)上調(diào)、9個(gè)下調(diào)，表達(dá)差異最明顯的為hsa-miR-126（上調(diào)）。hsa-miR-126可通過(guò)Ang-1、PDGF、p38MAPK、Smad2/3等靶基因來(lái)調(diào)控血管生成信號(hào)通路、慢性骨髓性白血病相關(guān)通路等信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。但本研究尚未進(jìn)一步確證hsa-miR-126參與調(diào)控的靶基因和信號(hào)通路，也并未考觀察患者的長(zhǎng)期療效和復(fù)發(fā)情況，加之樣本量和研究時(shí)間有限，故上述結(jié)論尚有待大樣本、多中心臨床研究予以證實(shí)。