汪衛(wèi)紅，許燁，李志明，遠(yuǎn)方

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽110032）

慢性腎功能衰竭（CRF）是由各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病導(dǎo)致的腎功能不可逆性減退，甚至功能喪失，其中代謝產(chǎn)物潴留、電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)及內(nèi)分泌異常等是各種腎臟疾病終末階段的共同表現(xiàn)[1-2］。臨床上主要采用透析、腎移植或相應(yīng)的對癥治療（如靜脈輸注5%碳酸氫鈉溶液糾正酸中毒、重組促人紅細(xì)胞生成素糾正貧血或骨化三醇治療腎性骨病等）等以緩解CRF癥狀，但上述治療方案不良反應(yīng)均較嚴(yán)重，且無法從本質(zhì)上阻止CRF的進(jìn)展[3］。大量研究表明，中醫(yī)藥療法可改善腎功能并延緩CRF的進(jìn)展，對CRF的治療具有重要意義[4-6］。黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.］的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效[7］。黃芪的主要成分為黃芪甲苷、黃芪多糖及多種類黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪及其水提物具有抗氧化、抗凋亡等作用，可改善CRF并調(diào)節(jié)糖尿病腎病模型大鼠的腎功能，但其作用機(jī)制尚未見深入探討[8-9］。有研究指出，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）在CRF模型大鼠體內(nèi)的磷酸化程度明顯增高，且可加重其氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10］，但黃芪對CRF模型大鼠的MAPK信號通路是否具有調(diào)節(jié)作用尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究通過建立CRF大鼠模型，探討黃芪水提物對其氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及MAPK信號通路的影響，以期為黃芪的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；BS-180型全自動(dòng)生化分析儀、MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；UV-5600型紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；7500型實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）儀（美國ABI公司）；Mini-Sub Cell GT Cell型水平核酸電泳儀、Trans-Blot SD型半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；5810R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

黃芪飲片購自安徽亳州藥材市場（批號:170926），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為豆科植物蒙古黃 芪[A.membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根。

貝那普利原料藥（陽性對照，批號:Y0001025，純度:＞98%）、腺嘌呤（批號:A8626）均購自美國Sigma公司；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170409、20170418、20170511、A001-1-1、A007-1-1、A003-1）；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號分別為KGERC007、KGEMC003、KGERC102a、KGP2100）；小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，內(nèi)參）、磷酸化p38 MAPK（pp38 MAPK）、ERK1/2、磷酸化JNK（p-JNK）抗體以及兔抗人p38 MAPK、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為3700、9216、4696、9255、8690、4377、9258）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為bs-0368R、bs-0295G）；RevertAidTM第1鏈cDNA合成試劑盒、TrizolTM試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為K1682、108304）；TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號:AQ131-02）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、免疫印跡發(fā)光（ECL）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為P0009、P0018S）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號:T1085）；蛋白上樣緩沖液（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號:MA0003）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購于遼寧長生生物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK（遼）2015-0001］。所有動(dòng)物均分籠飼養(yǎng)，室溫維持在20～25℃，濕度為50%，每日光照12 h。

2 方法

2.1 黃芪水提物的制備

稱取黃芪飲片500 g，粉碎，浸泡過夜后，分別用10倍量（g/L）水煎煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，得浸膏53.4 g（得率為10.68%）。將上述浸膏用水溶解，得質(zhì)量濃度為1 g/mL（按生藥量計(jì)）的黃芪水提物，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組（10只）和造模組（50只）。對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水；造模組大鼠均參照文獻(xiàn)[11-12］方法建立CRF模型:即灌胃25%腺嘌呤混懸液（以水為溶劑）200 mg/kg，每天1次，連續(xù)28 d。造模后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、貝那普利組（2 mg/kg；以水為溶劑；劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[13］）以及黃芪水提物低、中、高劑量組（1.5、3、6 g/kg，按生藥量計(jì)；以水為溶劑；劑量按臨床成人劑量的3、6、12倍換算而得），每組10只。對照組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物；每天1次，連續(xù)28 d[13］。

2.3 樣品的采集

末次給藥12 h后，處死各組大鼠，于腹主動(dòng)脈采血，10 000 r/min離心10 min，分離血清，于－20℃保存，備用。剝離各組大鼠的腎臟，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗，剔除周圍脂肪組織，用錫紙包裹后，于－80℃冰箱中保存，備用。

2.4 血清腎功能指標(biāo)及炎癥因子的檢測

采用比色法以全自動(dòng)生化分析儀檢測各組大鼠血清Scr、BUN、UA含量，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測

稱取各組大鼠腎組織200 mg，加生理鹽水適量，制成勻漿，10 000 r/min離心5 min，取上清液作為待測樣品，分別采用羥胺法、可見分光光度法及硫代巴比妥酸法（TBA）以紫外-可見分光光度計(jì)檢測各組大鼠腎組織中SOD、CAT活性和MDA水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.6 凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)的檢測

采用Real-time PCR法檢測。采用Trizol法提取各組大鼠腎組織總RNA 100 mg，加入TrizolTM試劑1 mL，反復(fù)吹打，按第1鏈cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得cDNA。以所得cDNA為模板，參照TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，各待測基因引物由北京賽諾科為生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成（引物序列見表1）。反應(yīng)體系（共20 μL）:cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環(huán)30次；72℃再延伸1 min。以β-actin作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量（Ct表示目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），本研究以Bax、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量的比值（Bax/Bcl-2）及Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量作為量化指標(biāo)。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2.7 MAPK信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blotting法檢測。將各組大鼠腎組織剪碎，按全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，于4℃下以12 000 r/min離心20 min，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，加入蛋白上樣緩沖液以體積比1∶1進(jìn)行稀釋，于100℃下變性10 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST溶液清洗，分別加入p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、β-actin一抗（加入量均為1∶1 000），于4℃下孵育過夜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min，隨后加入相應(yīng)二抗[β-actin、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-JNK:HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG二抗，p38 MAPK、p-ERK1/2、JNK:HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗；加入量均為1∶1 000］，室溫孵育1 h后，用TBST溶液清洗，以ECL顯色后，使用凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Image J 1.8.0軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參條帶的灰度值比值來表示該蛋白的相對表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪水提物對CRF模型大鼠血清腎功能指標(biāo)含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清Scr、BUN、UA含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清上述腎功能指標(biāo)含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而各給藥組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠血清中Scr、BUN、UA含量比較（x±s，n＝10）Tab 2 Comparison of serum contents of Scr，BUN and UAin rats of each group（x±s，n＝10）

3.2 黃芪水提物對CRF模型大鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述炎癥因子水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而各給藥組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（x±s，n＝10，ng/L）Tab 3 Comparison of serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats of each group（x±s，n＝10，ng/L）

3.3 黃芪水提物對CRF模型大鼠腎組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，貝那普利組及黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著升高，MDA含量均顯著下降，且貝那普利組MDA含量顯著低于黃芪水提物高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而其余給藥組上述指標(biāo)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 各組大鼠腎組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較（x±s，n＝10）Tab 4 Comparison of SOD and CAT activities，MDA contents in renal tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

3.4 黃芪水提物對CRF模型大鼠腎組織中凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2以及貝那普利組和黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，且貝那普利組Bax/Bcl-2顯著低于黃芪水提物高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而其余給藥組上述指標(biāo)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表5。

3.5 黃芪水提物對CRF模型大鼠腎組織中MAPK信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而各給藥組其余指標(biāo)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖1、表6。

表5 各組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量比較（x±s，n＝10）Tab 5 Comparison of Bax/Bcl-2 and mRNA related expression of Caspase-3 in renal tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

圖1 各組大鼠腎組織中MAPK信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 1 Electrophoregrams of the expression of MAPK signaling pathway-related regulatory proteins in renal tissue of rats in each group

表6 各組大鼠腎組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平比較（x±s，n＝10）Tab 6 Comparison of the expression of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK and p-JNK in renal tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

4 討論

CRF是各種慢性腎臟疾病所致腎功能惡化的結(jié)局之一，其主要生理表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率降低，腎小球和腎小管遭到破壞，從而導(dǎo)致機(jī)體代謝產(chǎn)物（如Scr、BUN等）聚集，最終進(jìn)展為尿毒癥[14］。目前主要的治療方案無法從根本上解決腎組織的損傷，且費(fèi)用較高、副作用明顯，患者極其痛苦[15］。因此，探索治療CRF的新途徑、新藥物顯得尤為重要。CRF屬中醫(yī)“關(guān)格”“腎勞”“溺毒”“水腫”“癃閉”等范疇，其病因病機(jī)皆與脾腎有關(guān)，脾腎兩虛易致濁毒內(nèi)蘊(yùn)[16］?！端貑枴ねㄔu虛實(shí)論》曰:“邪氣盛則實(shí)，精氣奪則虛”，表明CRF屬“本虛標(biāo)實(shí)”之證。黃芪是中醫(yī)治療CRF必不可少的一味藥材，其味甘、性微溫，歸脾肺經(jīng)?！墩渲槟摇吩?“黃芪甘溫純陽，其用有五:補(bǔ)諸虛不足，一也；益元?dú)猓?；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，?nèi)托陰疽，為瘡家圣藥，五也”。《本草匯言》贊其為“補(bǔ)肺健脾，實(shí)衛(wèi)斂汗，驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒之藥也”?？梢?，黃芪具補(bǔ)中益氣之力強(qiáng)之意，為治療CRF之要藥[17］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利是臨床治療CRF的主要藥物，可減少患者蛋白尿，并改善其腎功能[18］，故本研究將其作為陽性對照藥物。

Scr是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，主要由腎小球?yàn)V過排出體外，腎功能不全時(shí)，Scr在體內(nèi)蓄積使得其含量有所升高；BUN是血漿中除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物，其經(jīng)腎小球?yàn)V過而排出體外，當(dāng)腎功能不全失代償時(shí)，BUN含量將升高；UA為嘌呤代謝的終產(chǎn)物，在腎功能減退時(shí)，血中UA含量將升高[19-20］。由此可見，Scr、BUN、UA是臨床上反映患者腎功能損傷的重要指標(biāo)。本研究考察了黃芪水提物對CRF模型大鼠血清Scr、BUN、UA含量的影響。結(jié)果顯示，模型組大鼠血清Scr、BUN、UA含量均較對照組顯著升高；經(jīng)不同劑量黃芪水提物處理后，各給藥組大鼠血清Scr、BUN、UA含量均較模型組顯著降低。這提示黃芪水提物可提高CRF模型大鼠的腎小球?yàn)V過率，加快Scr、BUN、UA等代謝產(chǎn)物的排出。

血清炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)水平是反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)[21］。IL-1β可參與炎癥反應(yīng)后期纖維化的形成過程，并可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中蛋白激酶的活性，加重腎臟損傷；IL-6是與腎小球疾病關(guān)系最為密切的炎癥因子，主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等分泌；TNF-α由巨噬細(xì)胞分泌，可損傷腎小管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激成纖維細(xì)胞增殖，從而加快了腎纖維化的形成[22］。本研究采用ELISA法檢測了各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對照組顯著升高。這提示CRF可引發(fā)較為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，與文獻(xiàn)結(jié)果[21］基本一致。經(jīng)不同劑量黃芪水提物處理后，各給藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較模型組顯著降低。這提示黃芪水提物可有效抑制CRF模型大鼠的炎癥反應(yīng)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究指出，除炎癥反應(yīng)外，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在CRF的發(fā)病機(jī)制中亦扮演了重要的角色[23-24］。CRF患者體內(nèi)抗氧化酶活性的降低可導(dǎo)致其機(jī)體內(nèi)氧自由基無法被及時(shí)清除，使得氧自由基過剩，進(jìn)而加重氧化應(yīng)激反應(yīng)[15］。其中，SOD是反映氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)，CAT能有效清除生物體內(nèi)的自由基，兩者是減輕氧化應(yīng)激損傷的主要屏障；MDA能客觀反映過氧化物致?lián)p傷的嚴(yán)重程度[25］。本研究對各組大鼠腎組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著提高。經(jīng)不同劑量黃芪水提物處理后，與模型組比較，貝那普利組及黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著升高，MDA含量均顯著下降，且貝那普利組MDA含量顯著低于黃芪水提物高劑量組。這提示黃芪水提物可抑制CRF模型大鼠腎組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但作用可能弱于陽性對照藥物。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)在的一種程序性死亡，是維持機(jī)體細(xì)胞間平衡的關(guān)鍵因素，也是CRF發(fā)生的重要機(jī)制之一[23-24］。在凋亡發(fā)生過程中，Bcl-2與Bax以二聚體形式存在，當(dāng)Bcl-2表達(dá)多時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，而當(dāng)Bax表達(dá)多時(shí)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26］。Caspase-3是凋亡效應(yīng)蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)量有所增加，并誘導(dǎo)激活下游的Caspase效應(yīng)分子，從而啟動(dòng)凋亡的發(fā)生[27］。本研究采用Real-time PCR法檢測了各組大鼠腎組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量均較對照組顯著升高。這提示CRF可導(dǎo)致大鼠腎組織促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達(dá)增加，而使抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)降低，與文獻(xiàn)結(jié)果[28］基本一致。經(jīng)不同劑量黃芪水提物處理后，與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2以及貝那普利組和黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，且貝那普利組Bax/Bcl-2顯著低于黃芪水提物高劑量組。這提示黃芪水提物可通過調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相關(guān)因子mRNA的表達(dá)來降低CRF模型大鼠腎組織的細(xì)胞凋亡水平，但這種作用可能弱于陽性對照藥物。

MAPK級聯(lián)反應(yīng)是胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞調(diào)亡等過程[29］。在MAPK家族成員中，最早得以證實(shí)的是ERK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典通路，能調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，能夠改善腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化而減輕腎纖維化程度[30］。除ERK1/2之外，MAPK家族還包括p38 MAPK、JNK兩個(gè)成員。其中，p38 MAPK作為MAPK信號通路中的一員，是控制炎癥反應(yīng)的主要因子，在應(yīng)激條件下參與細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)過程。有研究表明，p38 MAPK與氧化應(yīng)激程度及腎纖維化進(jìn)展密切相關(guān)[31］。JNK家族是MAPK信號通路成員，可被炎癥因子（如IL-6、TNF-α等）、氧化損傷等多種因素激活，JNK信號通路在細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[32］。為探討黃芪水提物抗CRF作用與MAPK信號通路的相關(guān)性，本研究采用Western blotting法檢測了MAPK信號通路中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達(dá)量均較對照組顯著升高。經(jīng)不同劑量黃芪水提物處理后，與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低。這提示黃芪水提取可通過抑制p38 MAPK、ERK1/2及JNK蛋白的磷酸化來抑制MAPK信號通路，從而緩解CRF的進(jìn)展。

綜上所述，黃芪水提物對CRF模型大鼠具有一定的改善作用，可抑制其炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制MAPK信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究雖初步探討了黃芪水提物治療CRF模型大鼠的可能機(jī)制，為黃芪用以CRF的臨床治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但并未闡明其發(fā)揮作用的主要活性單體。本課題組后續(xù)將深入探討其活性單體，并進(jìn)一步闡明其具體作用機(jī)制。