孫 婷，張 菁，姜建國，劉紅莉

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011）

尼爾雌醇（Nilethylenol）是一種人工合成的非甾體類雌激素，是雌二醇與雌酮的代謝物。該藥的藥理作用與雌二醇相似，可在體內(nèi)代謝為炔雌三醇和雌三醇，以原型、炔雌三醇和雌三醇3種形式由尿液排出。有研究指出，在尼爾雌醇第3位碳原子上引入環(huán)戊醚后，可增加其親脂性，有利于腸道吸收并儲(chǔ)存在脂肪組織中而發(fā)揮長效作用；第17位碳原子上引入乙炔基后，可保護(hù)羥基并增強(qiáng)雌激素活性，但對(duì)子宮內(nèi)膜的增生作用較弱，可適用于圍絕經(jīng)期婦女的雌激素替代治療[1-3］。尼爾雌醇在合成工藝中使用了甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，為確保藥品有效、安全以及質(zhì)量可控，該藥按照2015年版《中國藥典》（四部）[4］、《藥品注冊(cè)的國際技術(shù)要求:質(zhì)量部分》[5］及其他相關(guān)要求[6］，應(yīng)增加對(duì)該藥有機(jī)溶劑殘留量的考察。目前，僅有2015年版《中國藥典》（二部）收載了尼爾雌醇原料藥和片劑的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7］，而《英國藥典》（2017年版）、《歐洲藥典》（9.0版）、《日本藥典》（17版）、《美國藥典》（41版）均未收載，也尚未見有關(guān)測定尼爾雌醇原料藥中有機(jī)溶劑殘留量的報(bào)道。為此，本研究采用氣相色譜法（GC）同時(shí)測定了尼爾雌醇原料藥中甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯7種有機(jī)溶劑的殘留量，旨在為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890B型GC儀，包括氫火焰離子化檢測器、柱溫箱（美國Agilent公司）；MCM36型百萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；XS205型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；UL TRASONIC型超聲波清洗機(jī)（北京中晟銘科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

尼爾雌醇原料藥（A公司，批號(hào):20170201A，純度:99.8%；B公司，批號(hào):20170202B，純度:99.6%；C公司，批號(hào):20170203C，純度:99.5%）；甲醇對(duì)照品（批號(hào):10945607812，純度:≥99.9%）、異丙醇對(duì)照品（批號(hào):k47208640544，純度:≥99.9%）、乙腈對(duì)照品（批號(hào):JA070530，純度:≥99.9%）均由美國Merck公司提供；乙醇對(duì)照品（批號(hào):20180524，純度:≥95.0%）、甲苯對(duì)照品（批號(hào):20171114，純度:≥99.5%）、乙酸乙酯對(duì)照品（批號(hào):20170824，純度:≥99.5%）均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；四氫呋喃對(duì)照品[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號(hào):H1602108，純度:≥99.9%］；甲醇、異丙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1.00 μm）；檢測器:氫火焰離子化檢測器；分流比:5∶1；載氣:氮?dú)猓兌?99.999%）；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:1 μL，直接進(jìn)樣；固定相:鍵合交聯(lián)聚乙二醇；升溫程序:初始溫度40℃，保持5 min，以10℃/min速率升溫至90℃，再以5℃/min速率升溫至200℃；進(jìn)樣口溫度：220℃；檢測器溫度：230℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液 精密量取甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯對(duì)照品適量，分別置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，得單一對(duì)照品溶液；分別取上述單一對(duì)照品溶液適量至同一量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋并定容，制成甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯質(zhì)量濃度分別為60、100、8.2、100、17.8、14.4、100 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取原料藥樣品20 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，即得。

2.2.4 空白對(duì)照溶液 以N，N-二甲基甲酰胺為空白對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度均大于1.5，空白對(duì)照溶液對(duì)待測物的測定無干擾。

圖1 氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，得系列單一線性關(guān)系工作溶液。取上述系列線性關(guān)系工作溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equation and linear range

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比為10∶1、3∶1計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯的定量限分別為0.24、0.40、0.033、0.40、0.071、0.058、0.40 μg/mL，檢測限分別為0.08、0.10、0.01、0.13、0.02、0.02、0.13 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯峰面積的RSD分別為0.5%、0.2%、0.4%、0.6%、0.3%、0.8%、0.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào):20170201A）適量，分別于室溫放置0、1、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯峰面積的RSD分別為1.4%、1.5%、1.3%、1.8%、1.1%、1.2%、1.7%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取原料藥樣品（批號(hào):20170201A）適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并以外標(biāo)法計(jì)算樣品中有機(jī)溶劑的殘留量。結(jié)果，甲醇、乙醇平均殘留量分別為0.01%、0.03%，峰面積的RSD分別為0.7%、0.9%（n＝6），其他成分未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào):20170201A），共9份，每份約20 mg，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并以外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表2Continued tab 2

2.10 樣品中有機(jī)溶劑殘留量測定

取3批原料藥樣品各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并以外標(biāo)法計(jì)算樣品中有機(jī)溶劑的殘留量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中有機(jī)溶劑殘留量的測定結(jié)果（n＝3，%%）Tab 3 Determination results of residual solvents in samples（n＝3，%%）

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

筆者比較了HP-5（弱極性）、DB-624（中等極性）、HP-210（中等極性）、AT-1000（極性）、DB-Wax（極性）等不同極性毛細(xì)管柱的分離效果，結(jié)果顯示以DB-Wax極性毛細(xì)管柱進(jìn)行分離時(shí)的分離效果最好，峰形尖銳且對(duì)稱，靈敏度較高，故選擇DB-Wax極性毛細(xì)管柱為本研究的色譜柱。

3.2 溶劑的選擇

尼爾雌醇原料藥在水中幾乎不溶，以水為溶劑時(shí)某些殘留有機(jī)溶劑亦不溶于水，且可能會(huì)包裹在未溶解的固態(tài)尼爾雌醇樣品中，而導(dǎo)致進(jìn)樣濃度不準(zhǔn)確，故不宜以水作為溶劑。有研究認(rèn)為，當(dāng)樣品不溶于水時(shí)，可選用高沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑為溶劑，因其出峰較晚故不會(huì)干擾測定[8］。而甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯均為中、低沸點(diǎn)的有機(jī)揮發(fā)性溶劑。因此，筆者參考上述文獻(xiàn)[8］，選擇N，N-二甲基甲酰胺為本研究的溶劑及稀釋劑。

3.3 有機(jī)溶劑殘留量測定結(jié)果分析

在原料藥合成生產(chǎn)過程中，未能完全去除的有機(jī)溶劑殘留量限度應(yīng)符合2015年版《中國藥典》（四部）[4］中的相關(guān)規(guī)定:甲醇不得超過0.3%、乙醇不得超過0.5%、乙腈不得超過0.041%、異丙醇不得超過0.5%、甲苯不得超過0.089%、四氫呋喃不得超過0.072%、乙酸乙酯不得超過0.5%。其中，甲醇、乙腈、甲苯、四氫呋喃為二類藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范質(zhì)量要求限制使用溶劑；乙醇、異丙醇、乙酸乙酯為三類限制使用溶劑。本研究中，甲醇、乙醇的測定結(jié)果均低于文獻(xiàn)[9］結(jié)果及2015年版《中國藥典》（四部）[4］中的相關(guān)規(guī)定，乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯在3批樣品中均未檢出，有機(jī)溶劑的殘留量符合2015年版《中國藥典》（四部）的要求。

此外，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-15］，建立了采用GC法同時(shí)測定尼爾雌醇原料藥中7種有機(jī)溶劑的殘留量。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具有良好的系統(tǒng)適用性，可為尼爾雌醇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

綜上所述，該方法靈敏度較高、準(zhǔn)確度較好，可用于同時(shí)測定尼爾雌醇原料藥中甲醇、乙醇、乙腈、異丙烷、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯的殘留量。