林適，吳瀟爍，陳柏行，陳超，吳宇航，周琦石，何才勇，#

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院一骨科，廣州 510405）

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種嚴重危害人類健康、以骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)異常為特征的代謝性骨疾病，其可引起骨脆性增加，增加患者骨折風險[1-2］。隨著社會人口老齡化，OP的發(fā)生率不斷上升，嚴重影響了老年人的健康及生活質(zhì)量[3］。由于其高發(fā)病率、高致殘率的特點，OP已經(jīng)成為世界普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[3］。目前，針對OP的防治藥物以骨吸收抑制劑、骨生成促進劑、骨礦化物為主（包括降鈣素、雙膦酸鹽、氟化物等），但這些藥物只能改善患者臨床癥狀、延緩病情，并不能從根本上改善骨代謝情況，亦不能恢復成骨與破骨進程的動態(tài)平衡，并且存在一定的副作用[2］。

目前，中醫(yī)藥治療OP已引起了國內(nèi)外學者的關(guān)注[4］。已有研究表明，骨碎補總黃酮能增強成骨細胞的活性，調(diào)節(jié)骨代謝過程中的細胞因子，降低破骨細胞活性，促進腸道對鈣的吸收和鈣在骨內(nèi)的沉積[5］，有望用于OP的治療。但中藥具有多組分特性，其作用于機體的機制也相對復雜，通過動物實驗或細胞試驗的方法研究中藥分子機制相對困難，而且會耗費大量人力物力。隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展，越來越多的相關(guān)研究成果使明確中醫(yī)藥發(fā)揮療效的分子機制成為可能[6-8］。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，分析骨碎補的有效活性成分、作用靶點及其可能的作用機制，同時通過網(wǎng)絡(luò)分析的方法進一步預測骨碎補抗OP的靶點，并對相關(guān)靶點進行通路富集分析，探討骨碎補治療OP的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 骨碎補中活性化合物及其作用靶點預測

通過中藥系統(tǒng)藥理學成分分析平臺（BATMANTCM）數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm）和GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）來預測骨碎補作用靶點。BATMAN-TCM是一個在線中藥分子機制的生物信息學分析工具，它的主要功能有中藥成分靶點預測、靶點的功能分析、相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的可視化及中藥的對比分析[9］，可通過“相似產(chǎn)物靶點相近”的原理進行靶點預測，用“留一法”（Leave-one-drug-out）互作交叉驗證進行預測的驗證，用已驗證過的化合物與蛋白的相互作用作為“金標準”來進行互作驗證[9］。GeneCards是一個綜合數(shù)據(jù)庫，參考了UniProt、AKS、PharmGKB等幾大數(shù)據(jù)庫對于基因的分析數(shù)據(jù)，可提供簡明的基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄、遺傳和功能上所有已知的和預測的人類基因[10］。本研究首先以“GUSUIBU”為檢索詞在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中檢索獲得骨碎補的化合物；同時，在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Cut-off值為20、P≤0.05，來預測骨碎補作用靶點；然后在GeneCards數(shù)據(jù)庫中設(shè)置候選靶點為“人類”，根據(jù)從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫得到的化合物進行靶點篩選；最后，取兩個數(shù)據(jù)庫獲得靶點的交集，得到骨碎補相關(guān)作用靶點。

1.2 OP相關(guān)疾病靶點檢索

檢索 TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB、CTD這6個公認的在線數(shù)據(jù)庫，設(shè)置關(guān)鍵詞為“Osteoporosis”，進行OP的已知相關(guān)疾病靶點檢索。對從這6個數(shù)據(jù)庫獲得的檢索結(jié)果進行匯總、對比分析并取交集，最終獲得OP疾病相關(guān)靶點。

1.3 骨碎補-OP疾病交集靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

對“1.1”“1.2”項下獲得的骨碎補相關(guān)作用靶點和OP已知疾病靶點取交集，提取整理交集靶點基因，通過STRING在線數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）進行蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；同時，運用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.6.1對獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進行處理分析獲得關(guān)鍵靶點，對生物分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)進行可視化展示，并通過力導向算法使網(wǎng)絡(luò)節(jié)點分布合理[11］，獲得清晰的可視化框架。

1.4 基因本體論分析

基因本體論（Gene ontology，GO）是用于描述基因產(chǎn)物功能并廣泛應(yīng)用于生物信息學領(lǐng)域的一個本體[12］。作為一個廣泛用于基因功能分類的系統(tǒng)，其涵蓋生物學的3個方面:生物途徑、細胞組分、分子功能[12］。本研究采用在線分析工具DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）對骨碎補-OP疾病交集靶點進行GO富集分析，通過統(tǒng)計學超幾何分布定量評估存在于各GO注釋中的蛋白質(zhì)群，以P值反映蛋白質(zhì)生物功能的顯著性（P＜0.05表示有顯著性）。DAVID是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學信息[13］。筆者在輸入目標基因列表后，目標基因會關(guān)聯(lián)到生物學注釋上，進而從無數(shù)個關(guān)聯(lián)的注釋中篩選出骨碎補-OP疾病交集靶點富集最具顯著性（P＜0.05為具有顯著性）的生物學注釋[13］。

1.5 KEGG通路富集分析

本研究應(yīng)用在線分析工具KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）對骨碎補-OP疾病交集靶點進行KEGG富集分析[14］。KEGG數(shù)據(jù)庫可通過輸入目標靶點，篩選出顯著富集的通路[15］。通路P值小于0.05時，則認為其是具有顯著性的關(guān)鍵通路；P值越小，則其顯著性程度越高。

1.6 關(guān)鍵基因的篩選及其對OP治療作用的預測

關(guān)鍵基因是指在生物學過程中發(fā)揮了舉足輕重作用的基因，并可在相關(guān)通路中調(diào)控其他基因發(fā)揮作用的過程[16］。關(guān)鍵基因是基于PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)篩選而得。但運用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建蛋白/基因的互作網(wǎng)絡(luò)后，往往會因為基因/蛋白等分子節(jié)點之間的相互連線而掩蓋關(guān)鍵基因[17］，因此需通過 MCC、DMNC、Degree、EPC、BottleNeck等算法對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和節(jié)點進行計算分析[17］，得到骨碎補治療OP的關(guān)鍵基因。其中的MCC算法是一種較新的算法，在預測重要基因方面更有優(yōu)勢[18］，因此本研究采取MCC算法進行關(guān)鍵基因的篩選，所得基因的分值越高，則其顯著性越高。

2 結(jié)果

2.1 骨碎補-OP疾病交集靶點的預測結(jié)果

通過BATMAN-TCM檢索得到骨碎補化合物7個，分別為柚皮素（Naringenin）、菜油甾醇（Campesterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、柚皮苷（Naringin）、γ-谷固醇（Gamma-Sitosterol）、蕓香柚皮苷（Narirutin）、桔皮苷（Hesperidin）；同時獲得其作用靶點共395個。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選獲得靶點234個。通過TTD等6個數(shù)據(jù)庫共篩選獲得OP的疾病靶點共761個。取上述三者的交集，最終獲得骨碎補-OP疾病交集靶點共136個，其網(wǎng)絡(luò)可視化圖譜見圖1（圖中，矩形和三角菱形分別為骨碎補及其化合物，圓形為篩選獲得的交集靶點）。

2.2 骨碎補-OP疾病交集靶點的GO分析結(jié)果

GO分析結(jié)果顯示，136個骨碎補-OP疾病交集靶點的生物途徑主要包括Response to chemical（化學反應(yīng)）、Steroid metabolic process（類固醇代謝過程）、Cellular response to chemical stimulus(細胞對化學刺激的應(yīng)答）等；基因所處細胞組分主要包括Extracellular space（細胞外間隙）、Extracellular region part（胞外區(qū)部分）、Cytoplasmic part（細胞質(zhì)）等；分子功能主要包括Heme binding（血紅素結(jié)合）、Tetrapyrrole binding（四吡咯結(jié)合）、Monooxygenase activity（單氧酶活性）等，詳見表1。

圖1 骨碎補-OP疾病交集靶點DPI可視化圖譜Fig 1 PPI visualization map of D.rhizoma-OP disease intersection target

2.3 KEGG通路富集分析結(jié)果

對136個骨碎補-OP疾病交集靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，P值小于0.05的骨碎補治療OP所涉及的信號通路有136個，主要與骨代謝、內(nèi)分泌、炎癥、腫瘤、細胞凋亡等相關(guān)。顯著性程度排前7位的信號通路見表2，排前80位的信號通路結(jié)果見圖2（圖中，圓形節(jié)點為信號通路，其大小越大，則表示通路顯著性程度越高）。

2.4 關(guān)鍵基因分析結(jié)果

根據(jù)MCC算法獲得顯著性程度排前30位的靶點作為骨碎補-OP疾病交集靶點中的關(guān)鍵基因，按顯著性由高到低排序分別為ALB、AKT1、JUN、BCL2、CASP3、PTGS2、NFKB1、MAPK8、MAPK1、IGF1、FOS、MMP9、CYCS、CCL2、IL1B、PPARG、EDN1、LEP、CAT、APOE、ESR1、IL2、NOS3、ICAM1、CASP8、BAX、PARP1、PCNA、CDKN1A、CASP9，詳見圖3（圖中，圓形節(jié)點為非關(guān)鍵基因，六邊形為關(guān)鍵基因，關(guān)鍵基因節(jié)點顏色由淺至深以及節(jié)點大小由小至大均表示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性升高）；富集關(guān)鍵基因數(shù)目≥5個的通路見表3。

表1 骨碎補-OP疾病交集靶點GO分析結(jié)果Tab 1 GO analysis of D.rhizoma-OP disease intersection target

表2 KEGG通路富集分析中顯著性程度排前7位的信號通路Tab 2 Top 7 signaling pathways in the list of significance degree in KEGG pathway enrichment analysis

3 分析與討論

OP在老年人中非常常見，而隨著社會人口老齡化的加劇，OP患者數(shù)量也將不斷增加。從中醫(yī)病機來看，OP與腎虛關(guān)系密切[4］。研究發(fā)現(xiàn)，補腎類中藥具有促進成骨細胞增殖、抑制破骨細胞活性、調(diào)節(jié)雌激素水平及其受體、促進骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）成骨并抑制其成脂，調(diào)節(jié)骨保護蛋白（OPG）/核因子κB受體活化因子（RANK）/核因子κB受體活化子配體（RANKL）系統(tǒng)和鈣磷代謝等作用[19］。補腎類中藥具有補腎陽、強筋骨、益精髓等作用，對臨床治療OP具有重要意義[4，19-20］。骨碎補就是可用于治療OP的補腎類中藥，已有研究證實其總黃酮具有抗OP的潛力[20］。

圖2 KEGG通路富集分析中顯著性程度排前80位的信號通路Fig 2 Top 80 signaling pathways in the list of significance degree in KEGG pathway enrichment analysis

圖3 關(guān)鍵基因分析顯著性程度排前30位的骨碎補-OP疾病交集靶點可視化圖譜Fig 3 Visualization map of top 30 D.rhizoma-OP disease intersection targets in the list of significance degree of key gene analysis

骨碎補屬于真蕨目骨碎補科蕨類植物，其味苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有活血續(xù)傷、補腎強骨的功效，在臨床上對OP有很好的療效[20-21］。本研究通過BATMANTCM數(shù)據(jù)庫檢索獲得骨碎補的7個化合物，進一步通過BATMAN-TCM結(jié)合GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得化合物作用靶點，再通過公認的TTD等6個在線數(shù)據(jù)庫檢索獲得OP疾病靶點，最后取三者交集獲得骨碎補-OP疾病交集靶點136個。由圖1PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，骨碎補的7個化合物可作用于多個靶點，而PPARG、ESR1、AR等靶點也可與多個骨碎補化合物產(chǎn)生相互作用。這提示骨碎補有效成分之間存在協(xié)同作用。

表3 富集關(guān)鍵基因數(shù)目≥5個的通路Tab 3 Pathways with more than 5 key enrichment genes

通過KEGG通路富集分析，由表2可見，Pathways in cancer（癌癥信號通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications[晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE/RAGE）信號通路］、Hepatitis B（乙型肝炎信號通路）、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）、Apoptosis（細胞凋亡信號通路）、Proteoglycans in cancer（癌癥中的蛋白聚糖信號通路）和Endocrine resistance（雌激素信號通路）是骨碎補對OP發(fā)揮作用顯著性程度最高的信號通路。這些通路都較為復雜，包括多個下游通路。例如癌癥信號通路的下游通路包括Wnt信號通路、Hedgehog信號通路、Notch信號通路、低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）信號通路等。又如AGE/RAGE信號通路可通過調(diào)控蛋白激酶C（PKC）、p38 MAPK、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、核因子κB（NF-κB）以及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）信號通路從而調(diào)節(jié)細胞和系統(tǒng)反應(yīng)，增加骨基質(zhì)蛋白的表達[22］。TNF信號通路包括細胞凋亡、細胞存活、炎癥和免疫在內(nèi)的多個細胞內(nèi)信號通路。TNF主要有TNFR1和TNFR2兩種受體，TNFR1信號通路可激活誘導許多基因的激活，主要受兩種不同的途徑控制:NF-κB途徑和MAPK級聯(lián)途徑；TNFR2信號通路可激活NF-κB信號通路，包括磷酸肌醇3激酶（PI3K）依賴性NF-κB信號通路和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路。結(jié)合圖2可見，除了上述復雜的信號通路外，骨碎補活性成分還可直接調(diào)控這些通路包含的下游通路。

通過關(guān)鍵基因的篩選及分析，由表3可見，關(guān)鍵基因在以上這些通路中的富集數(shù)目有30個，其P值均不大于1.96×10－9，進一步說明這些通路的重要性。

4 結(jié)語

骨碎補抗OP作用主要可歸結(jié)為直接調(diào)控骨代謝和間接調(diào)節(jié)骨代謝兩個方面，主要作用于成骨、破骨過程，使兩個進程維持平衡。OP的發(fā)生與發(fā)展的病因主要是成骨和破骨的動態(tài)平衡被打破，因此與此相關(guān)的信號通路均可能作為抗OP治療的主要通路。直接調(diào)節(jié)骨代謝通路包括Wnt信號通路、Notch信號通路、TGF-β信號通路、破骨細胞分化信號通路、MAPK信號通路、Hedgehog信號通路等。其中，Wnt蛋白是一組分泌的糖蛋白，是促進成骨細胞分化和活性的重要調(diào)節(jié)因子[23］。TGF-β信號通路在骨形成過程中扮演著重要角色，能促進骨母細胞增殖和早期分化，抑制破骨細胞活性[24-26］。Notch信號通路調(diào)節(jié)MSCs向成骨細胞分化，推動成骨進程，并具有抑制成骨細胞分化及降低骨量的作用[27-29］。MAPKs在成骨細胞發(fā)育過程中起著重要作用，通過作用于成骨細胞調(diào)節(jié)骨形成[30］。Hedgehog信號通路主要參與促進MSCs向成骨細胞及軟骨細胞分化，而阻止其向脂肪細胞分化[31-32］。其他顯著性程度相對較高的通路如雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、甲狀腺信號通路、HIF-1信號通路等可通過間接調(diào)節(jié)骨代謝發(fā)揮抗OP作用。

綜上，骨碎補治療OP的作用機制呈多靶點、多通路、多系統(tǒng)的特性，除了影響骨代謝相關(guān)途徑，還可影響體內(nèi)多種代謝途徑。