陳鑫，李翔，羅曉健，劉微（1.江西中醫(yī)藥大學藥學院，南昌330006；2.江西中醫(yī)藥大學創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設備國家重點實驗室，南昌 330038）

原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌癥發(fā)病率居于第5位的常見腫瘤，我國HCC患者數(shù)約占世界總數(shù)的50%以上[1］。經(jīng)導管動脈栓塞術是治療中、晚期HCC的首選方法[2］。有研究認為，HCC治療的新策略是將經(jīng)導管動脈栓塞術與化療藥物灌注相結合，該策略既能選擇性阻斷腫瘤細胞血供，又可導致腫瘤細胞缺少必要的營養(yǎng)供應而壞死，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷力，同時降低藥物的系統(tǒng)毒性[3］。索拉非尼是被證實有效的第一個系統(tǒng)應用于晚期肝癌的多靶點、多激酶抑制劑[4］，具有抑制血管新生的作用。紫杉醇能夠與微管蛋白結合，有效促進微管聚合，從而通過抑制微管解聚使腫瘤細胞有絲分裂終止，最終導致腫瘤細胞凋亡[5］。于在慶等[6］發(fā)現(xiàn)，紫杉醇聯(lián)合索拉非尼經(jīng)導管動脈栓塞術治療中晚期肝癌的療效顯著優(yōu)于紫杉醇單一化療，且安全性較好。但市售的紫杉醇多為注射劑，易引起嚴重的過敏反應，索拉非尼多為口服制劑，不良反應較多。因此，對于兩種藥物新劑型的研究已成為熱點。

載藥栓塞微球是一種以高分子材料為載體，將藥物包裹成直徑為1～500 μm的微小球狀實體，可直接經(jīng)動脈管導入，阻塞在腫瘤細胞血管，其既可阻斷腫瘤細胞血供，所釋放的藥物又可抑殺腫瘤細胞，具有雙重抗腫瘤的作用[7］；此外，還可減少給藥次數(shù)，提升患者用藥的方便性和依從性，減少不良反應。載藥栓塞微球的釋放度是其質量控制的關鍵指標之一。為提高患者用藥的依從性，減少給藥次數(shù)，本研究以紫杉醇和索拉非尼為模型藥，聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）為微球材料，制備了紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球，并對其表征及體外釋藥特性進行了考察，旨在為肝癌的治療提供更多的參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、Rev.B.04.03色譜工作站（美國Agilent公司）；ZNCL-G型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；3000型激光粒度儀（英國Malvern公司）；CX31型光學顯微鏡（日本Olympus株式會社）；FEI Quanta 250型掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；SHZ-82A型氣浴恒溫振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）；KQ-5200型超聲波清洗機（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HC-3018R型離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；AB204-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇原料藥（江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司，批號:20160819，純度:99.50%）；索拉非尼原料藥（臺州市鴻耀化工有限公司，批號:20170331，純度:99.49%）；紫杉醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:100382-201603，純度:99.90%）；索拉非尼對照品（德國Bayer公司，批號:PY637215，純度:99.50%）；PLGA[山東省醫(yī)療器械研究所，批號:20170316，分子量:10 000 Da、20 000 Da、30 000 Da，丙交酯（LA）-乙交酯（GA）（50∶50，摩爾比）］；甲醇、乙腈均為色譜純；二水合磷酸二氫鈉鹽、十二水合磷酸氫二鈉鹽、聚山梨酯80、聚乙烯醇1788等均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 載藥栓塞微球的制備

2.1.1 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球[8-9］。分別精密稱取紫杉醇原料藥、索拉非尼原料藥各適量，置于小燒杯中，加二甲基亞砜0.5 mL溶解，后加PLGA（10 000 Da）適量，加二氯甲烷5 mL溶解，超聲（功率:200 W，頻率:40 kHz，下同）處理5 min使其完全溶解，作為油相。另配制含聚乙烯醇1788的水溶液作為水相，于0℃冰浴條件下將油相緩慢滴入水相，以400 r/min磁力攪拌，滴加完畢后繼續(xù)攪拌0.5 h，再于25℃條件下繼續(xù)攪拌6 h，待有機溶劑揮發(fā)完全，微球固化，經(jīng)0.8 μm微孔濾膜濾過，收集膜表面微球，以水洗滌3次后，干燥24 h，得紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球，共制備3批（批號:20180622、20180623、20180624）。

2.1.2 空白微球的制備 不加紫杉醇原料藥、索拉非尼原料藥，按“2.1.1”項下方法制備空白微球。

2.2 紫杉醇、索拉非尼的含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱:Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相:水-乙腈（40∶60，V/V）；流速:1.0 mL/min；檢測波長:228 nm；柱溫:28℃；進樣量:10μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒質量的紫杉醇對照品、索拉非尼對照品各20.00 mg，精密稱定，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得混合對照品貯備液，取上述混合對照品貯備液2 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得紫杉醇、索拉非尼質量濃度均為0.40 mg/mL的混合對照溶液。精密量取上述混合對照溶液2.5 mL，加甲醇定容，得紫杉醇、索拉非尼質量濃度均為0.10 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1.1”項下紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球約40 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加二氯甲烷適量，超聲處理5 min使載藥栓塞微球完全溶解，加甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 取“2.1.2”項下空白微球適量，按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以紫杉醇和索拉非尼峰計均不低于3 000，保留時間分別為6.91、11.04 min，陰性對照溶液對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.6 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下混合對照溶液0.05、0.1、0.25、0.5、5、10 mL，加甲醇定容至10 mL，制成質量濃度分別為 2.0、4.0、10.0、20.0、200.0、400.0 μg/mL的系列線性關系工作溶液。分別取上述系列線性關系工作溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得紫杉醇、索拉非尼回歸方程分別為y＝22.196x+22.031（r＝0.999 6）、y＝24.925x+30.445（r＝0.999 6），結果表明，紫杉醇、索拉非尼檢測質量濃度線性范圍均為2.0～400.0 μg/mL。

2.2.7 定量限與檢測限考察 取“2.2.2”項下混合對照溶液適量，倍比稀釋，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結果，紫杉醇、索拉非尼的定量限分別為1.902 6、1.890 2 μg/mL，檢測限分別為0.985 5、1.264 5 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗 取“2.2.6”項下系列線性關系工作溶液（質量濃度為 4.0、10.0、200.0 μg/mL）適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積并計算日內精密度；按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣5 d，記錄峰面積并計算日間精密度。結果，紫杉醇、索拉非尼峰面積的日內RSD分別為0.28%、0.92%（n＝6）；紫杉醇、索拉非尼峰面積的日間RSD分別為0.44%、1.08%（n＝5），表明日內和日間精密度均較好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號:20180624）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24、48 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，紫杉醇、索拉非尼峰面積的RSD分別為1.14%、1.21%（n＝8），表明供試品在室溫下放置48 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.10 重復性試驗 取“2.1.1”項下紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球（批號:20180624）適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并以回歸方程計算樣品含量。結果，紫杉醇、索拉非尼的平均含量分別為11.20、8.51 mg/g，RSD分別為0.67%、0.86%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.11 回收率試驗 取“2.1.2”項下空白微球適量，共9份，加入一定量的混合對照溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表1。

2.2.12 樣品含量測定 取“2.1.1”項下3批紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并以回歸方程計算樣品中紫杉醇、索拉非尼的含量，結果見表2。

2.3 載藥量和包封率的測定

按“2.1.1”項下方法分別制備以3種不同分子量PLGA為載體的紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球。分別精密稱取上述紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球40 mg，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品中紫杉醇、索拉非尼的含量，進而計算3種微球中紫杉醇、索拉非尼的載藥量和包封率，詳見表3。載藥量（%）＝（微球中藥物質量/微球的總質量）×100%；包封率（%）＝（微球中藥物質量/藥物的投藥量）×100%。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

表3 不同分子量PLGA的紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的載藥量和包封率（n＝3，%%）Tab 3 Drug-loading amount and encapsulation efficiency of Paclitaxel-sorafenib-PLGA-loaded embolic microspheres with different molecular weights（n＝3，%%）

由表3可知，隨著PLGA分子量的減小，紫杉醇、索拉非尼的包封率呈現(xiàn)遞增趨勢，其原因可能為PLGA為直鏈線性分子，隨著其分子量的增加，PLGA鏈段的分子鏈長度隨之增加，其與二氯甲烷有機相黏度也隨之增加[10］。PLGA的分子量對親水性藥物和疏水性藥物的載藥量、包封率影響不同，對于親水性藥物，增加PLGA的分子量，微球的載藥量和包封率增加，但疏水性藥物則相反。綜合考慮，選擇PLGA分子量為10 000 Da。

2.4 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的表征

2.4.1 粒徑及粒徑分布 采用激光粒度儀以濕法[11-12］測定紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的粒徑，粒徑分布見圖2。

由圖2可知，紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的平均粒徑為（139±1.16）μm，微球粒徑分布集中，粒徑比較均一。

圖2 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的粒徑分布Fig 2 Particle size distribution of Paclitaxel-sorafenib-PLGA-loaded embolic microspheres

2.4.2 外觀形態(tài) 取紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球適量，用水分散后，置于光學顯微鏡下觀察。結果，紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球形態(tài)圓整，表面光滑無粘連，分散性良好，詳見圖3。另取適量紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球，均勻分散在貼有導電膠的載樣臺噴金后，采用掃描電子顯微鏡（電子束強度為10 kV）觀察微球表面形態(tài)。結果，微球表面光滑無突起，無明顯藥物結晶存在，提示藥物被包裹于載體材料中，詳見圖4。

圖3 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的顯微鏡圖（×40）Fig 3 Micrograph of Paclitaxel-sorafenib-PLGA-loaded embolic microspheres（×40）

圖4 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的掃描電鏡圖（×2 100）Fig 4 Scanning electron microscopy of Paclitaxelsorafenib-PLGA-loaded embolicmicrospheres（×2 100）

2.5 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球的體外釋放度試驗

取紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球約100 mg，共168份（分別設置70、60、50、37 ℃ 4個溫度，每個溫度設14個取樣點，平行3份），精密稱定，放入釋放瓶中，加釋放介質（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4；含1%聚山梨酯80）150 mL（符合漏槽條件），分別置于氣浴恒溫振蕩器中，轉速75 r/min，進行體外釋放試驗。分別于1、2、3、4、6、8、12、15、18、21、26、31、36、41 d時取出釋放瓶，以0.8 μm微孔濾膜濾過，分離得到微球，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下含量測定方法測定微球中剩余藥物的含量，并計算紫杉醇、索拉非尼的累積釋放度（Q，Q＝藥物累積釋放量/初始微球中藥物總質量×100%）[13］，以時間（t，d）為橫坐標、藥物累積釋放度（Q，%）為縱坐標繪制釋放曲線，結果見圖5、圖6。結果顯示，紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球在70℃下，4 d內紫杉醇的Q為（93.65±5.64）%，索拉非尼的Q為（90.17±4.37）%；在60℃下，12 d內紫杉醇的Q為（91.20±6.28）%，索拉非尼的Q為（94.03±6.38）%；在50℃下，15 d內紫杉醇的Q為（81.5±3.04）%，索拉非尼的Q為（84.84±7.89）%；在37℃下，41 d內紫杉醇的Q為（71.83±3.96）%，索拉非尼的Q為（81.44±6.02）%，提示在較高溫度下，微球中的紫杉醇、索拉非尼可在短時間內接近完全釋放，而在37℃下具有良好的緩釋作用。

紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球體外釋放數(shù)據(jù)分別采用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程進行擬合，發(fā)現(xiàn)兩藥均符合一級動力學方程（r＞0.99），詳見表4。

圖5 不同溫度下紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球中紫杉醇的體外釋放曲線Fig 5 Release curves of paclitaxel from Paclitaxelsorafenib-PLGA-loaded embolic microspheres prepared at different temperatures

圖6 不同溫度下紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球中索拉非尼的體外釋放曲線Fig 6 Release curves of sorafenib from Paclitaxelsorafenib-PLGA-loaded embolic microspheres prepared at different temperatures

表4 紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球體外釋放數(shù)據(jù)的模型擬合結果Tab 4 Model fitting results of in vitro release data of Paclitaxel-sorafenib-PLGA-loaded embolic microspheres

2.6 體外釋放曲線的預測與實測

采用阿倫尼烏斯方程計算70、60、50、37℃溫度下紫杉醇、索拉非尼的反應速率常數(shù)k，以lg k對1/絕對溫度（T）繪制標準曲線，同時預測37℃溫度下紫杉醇、索拉非尼的反應速率常數(shù)k1，并與實測（k0）進行比較，結果見圖7、表5。采用一級動力學方程繪制37℃下紫杉醇、索拉非尼不同時間點的預測釋放度曲線，同時采用DD-solver 1.0藥物溶出度數(shù)據(jù)處理軟件將預測（37℃）曲線與實測（37℃）曲線進行相似因子（f2）擬合，結果見圖8。

圖7 不同溫度下紫杉醇、索拉非尼反應速率常數(shù)的預測值與實測值曲線Fig 7 Predicted and measured value curves of reaction rate constant of paclitaxel and sorafenib at different temperatures

表5 37℃溫度下紫杉醇、索拉非尼反應速率常數(shù)的預測值與實測值Tab 5 Predicted and measured value curves of reactionrate constant of paclitaxel and sorafenib at 37℃

由圖7、表5可知，在37℃下紫杉醇、索拉非尼k1與k0的RSD小于10%，提示所建動力學模型可行。

由圖8可知，相關數(shù)據(jù)經(jīng)DDsolver 1.0藥物溶出度數(shù)據(jù)處理軟件處理后，得到紫杉醇、索拉非尼的f2分別為83.53、73.95，提示紫杉醇、索拉非尼在37℃下的實測釋放曲線與預測釋放曲線的f2符合50≤f2＜100的要求[14］，模型擬合成功，兩條曲線具有相似性。

圖8 37℃溫度下紫杉醇、索拉非尼釋放度的預測值與實測值曲線Fig 8 Predicted and measured value curves of release rate of paclitaxel and sorafenib at 37℃

3 討論

本研究采用高效液相色譜法測定了紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球中紫杉醇和索拉非尼的含量，該方法穩(wěn)定性較好，操作簡便。

PLGA作為降解材料可長期使用，且在體內無蓄積，能延緩藥物釋放時間，降低藥物毒性，是載藥栓塞微球常用的載體材料之一[15］。乳化-溶劑揮發(fā)法操作簡單，在油相的選擇上，二氯甲烷對PLGA的溶解性極好，且易于揮發(fā)，使微球固化成球[16］。

紫杉醇是一種高度親脂性藥物，故其向外水相的擴散趨于最小化，而致紫杉醇的包封率與載藥量均高于索拉非尼。有研究認為，肝臟使用的栓塞微球粒徑應大于40 μm，粒徑偏小易通過側枝循環(huán)分布到肺、脾等部位，而增加副作用[17］。因此，粒徑是載藥栓塞微球質量控制的重要因素之一。

在37℃下，為保證漏槽條件及釋放介質體積較大，使釋放在介質中的藥物濃度較低，這不利于具有高靈敏度藥物的含量測定。故本研究采用分離微球與釋放介質，測定微球中剩余藥物的含量，間接計算微球的釋放度，以降低檢測難度。

釋放度在生理溫度（37℃）下進行，試驗周期較長，需要數(shù)天、幾個月甚至1年以上的時間。因此，尋找一種具有良好相關性的體外釋放度預測試驗方法，可縮短處方工藝優(yōu)化的周期，節(jié)約試驗成本，對快速檢測載藥栓塞微球的質量具有重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)，納曲酮-PLGA載藥微球在生理溫度下（37℃）與高溫狀態(tài)下的釋放曲線具有相關性[18］。Aso Y等[19］研究表明，孕酮的藥物釋放度可隨溫度的升高而顯著增加。Zolnik BS等[20］研究表明，地塞米松PLGA載藥微球高溫狀態(tài)下的釋放度顯著加快。本研究考察了紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球在高溫條件下的釋藥特性，通過升高介質溫度，來達到加快載藥栓塞微球釋藥的目的；通過對兩藥的累積釋放度進行了預測，并將預測曲線與實測曲線進行擬合。結果表明，紫杉醇-索拉非尼-PLGA載藥栓塞微球在較高溫度（70、60、50℃）下的釋放度與藥物生理溫度（37℃）下的釋放度存在相關性，提示采用高溫預測試驗替代藥物生理溫度（37℃）下釋放試驗具有一定的可能性，能有效縮短試驗時間，尤其適用于降解周期較長的PLGA樣品的降解試驗[17］。

綜上所述，成功制得紫杉醇-索拉非尼-PLGA栓塞微球，其形態(tài)較好，具有較好的緩釋作用；預測釋放曲線與實測釋放曲線相關性較好；所建含量測定方法操作簡便，穩(wěn)定性較好。