祝俠麗，王莎莎，李玲華，巴妍妍，劉黎明，賈永艷

（河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046）

惡性腫瘤已成為威脅人類健康的一大殺手，也是現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。鹽酸阿霉素（Doxorubicin hydrochloride，DOX）作為一種廣譜抗腫瘤藥物，因其普通劑型具有明顯的系統(tǒng)毒性而被臨床限制使用[1］。納米脂質(zhì)體可通過高通透性和滯留效應(yīng)（Enhanced permeability and retention effect，EPR）將化療藥物靶向輸送到腫瘤組織，可提高藥物的療效，并降低毒性，同時具有明顯的緩釋作用和較高的生物相容性[2］。盡管聚乙二醇（PEG）化的DOX脂質(zhì)體已應(yīng)用于臨床，但仍存在藥物被動釋放速度過慢等問題[3］。近年來，基于納米材料的腫瘤光熱治療（Photothermal therapy，PTT）技術(shù)作為一種新型的治療方法，因其特異性強、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少等優(yōu)勢，逐漸受到學(xué)者的關(guān)注[2］。納米硫化銅因具有成本低、光熱穩(wěn)定性好、細胞毒性低以及粒徑、形貌可控等特點[4］，在PTT領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景。為此，本研究將納米硫化銅和DOX共同包裹制備了具有近紅外光響應(yīng)性的DOX納米脂質(zhì)體，并通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化DOX納米脂質(zhì)體的制備工藝，旨在為PTT的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-100型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-1100-OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；92-llN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；T6-1650E型新世紀紫外-可見分光光度（UV）計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Nano-ZS90型電位及粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；MW-GX-808/3000 mW型激光器（中國科學(xué)院長春激光所）。

1.2 藥品與試劑

DOX原料藥（大連美倫生物技術(shù)有限公司，批號:25316-40-9，純度:≥99%）；豆磷脂（天津市光復(fù)精細化工研究所，批號:20160403）；膽固醇（鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司，批號:20150527）；納米硫化銅（河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制，批號:20180317）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，批號:20171204）、聚維酮（批號:20161009）均由北京博奧拓達科技有限公司提供；三氯甲烷、甲醇等均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 DOX納米脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法[5-6］。精密稱取豆磷脂、膽固醇各適量，置于同一茄形瓶中，加三氯甲烷適量溶解，搖勻，后將茄形瓶于40℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)以除去有機溶劑，至形成均勻的薄膜，后加入含有DOX和聚維酮、納米硫化銅的PBS溶液，超聲（功率:500 W，頻率:40 kHz）處理20 min，后再超聲（功率:250 W，頻率:25 kHz）處理，每次3 s，間歇3 s，共循環(huán)20次，即得含有納米硫化銅的DOX納米脂質(zhì)體。另取薄膜，加入含有聚維酮、納米硫化銅的PBS溶液，按上述操作“超聲處理20 min起至超聲處理”，即得空白脂質(zhì)體。

2.2 DOX納米脂質(zhì)體的含量測定

2.2.1 檢測波長的確定 采用UV法測定含量[7］。精密稱取DOX原料藥5.05 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.01 mg/mL的DOX貯備液；取上述DOX貯備液適量，加甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為8.08μg/mL的DOX供試品溶液。另取“2.1”項下空白脂質(zhì)體適量，加甲醇破乳，加甲醇稀釋100倍，即得空白脂質(zhì)體供試品溶液。以甲醇為空白對照，取上述DOX供試品溶液、空白脂質(zhì)體供試品溶液于200～400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，詳見圖1。由圖1可知，DOX供試品溶液的最大吸收波長為232 nm，而空白脂質(zhì)體供試品溶液在232 nm波長處無吸收，表明空白輔料對測定無干擾，故選擇檢測波長為232 nm。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項下DOX貯備液，加PBS溶液稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為1.01、4.04、8.08、12.12、16.16 μg/mL的系列線性關(guān)系工作溶液，取上述系列線性關(guān)系工作溶液適量，分別于232 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得DOX的回歸方程為y＝0.056 7x+0.014 9（r＝0.999 7），結(jié)果表明，DOX檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.01～16.16μg/mL。經(jīng)方法學(xué)驗證，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合2015年版《中國藥典》（四部）要求[8］。

圖1 紫外吸收光譜圖Fig 1 UV absorption spectrum

2.3 包封率、載藥量、粒徑的測定

采用超濾離心法測定包封率和載藥量[9-10］。精密量取“2.1”項下DOX納米脂質(zhì)體0.2 mL，加甲醇破乳并定容至5 mL，于232 nm波長處測定吸光度，記為A總。精密量取“2.1”項下DOX納米脂質(zhì)體1 mL，置于超濾管（30 kDa）中，以5 000 r/min離心20 min，濾過，取續(xù)濾液0.2 mL，加水定容至5 mL，于232 nm波長處測定吸光度，記為A游。將A總、A游按“2.2.2”項下回歸方程計算DOX質(zhì)量濃度，并按如下公式計算包封率和載藥量。包封率（%）＝（W總－W游）/W總×100%，載藥量（%）＝（W總－W游）/M總×100%（式中，W總表示總的藥物質(zhì)量，W游表示游離藥物的質(zhì)量，M總表示DOX納米脂質(zhì)體的總質(zhì)量）。另取“2.1”項下DOX納米脂質(zhì)體適量，加超純水稀釋10倍，采用粒度分析儀測定粒徑。

2.4 DOX納米脂質(zhì)體處方工藝優(yōu)化

2.4.1 星點試驗設(shè)計與結(jié)果 參考預(yù)試驗結(jié)果及相關(guān)文獻[11-13］，選擇以豆磷脂與藥物質(zhì)量比（X1，mg/mg）、豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比（X2，mg/mg）、超聲時間（X3，min）為因素，以粒徑（Y1，nm）、包封率（Y2，%）、載藥量（Y3，%）為指標(biāo)，采用3因素3水平試驗方案。因素與水平見表1，試驗方案與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

2.4.2 模型擬合 采用SPSS 17.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得P＝0.411（P＞0.05），提示包封率在各組之間的差別相對較?。≒＞0.05）。因此，以粒徑和載藥量為指標(biāo)，采用Design-expert 8.0.6軟件進行多元二次多項回歸擬合，得粒徑和載藥量對X1、X2、X3的數(shù)學(xué)回歸模型。以粒徑為指標(biāo)時，Y1＝215.30－123.90X1+13.82X2+13.13X3－33.07X1X2－25.38X1X3+1.23X2X3+77.49X12+5.09X22+2.94X32（r＝0.985 4）；以載藥量為指標(biāo)時，Y3＝5.56－4.40X1+0.21X2－0.046X3+0.075X1X3－0.017X2X3+2.38X12－0.056X22－0.021X32（r＝0.999 9）。r均大于0.9，提示模型設(shè)計的擬合效果及預(yù)測性均較好。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 試驗方案與結(jié)果Tab 2 Experiment plan and results

2.4.3 各因素交互作用分析 采用Design-expert 8.0.6軟件以豆磷脂與藥物質(zhì)量比（X1，mg/mg）、豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比（X2，mg/mg）、超聲時間（X3，min）為因素，以粒徑（Y1，nm）和載藥量（Y3，%）為指標(biāo)，繪制響應(yīng)面圖，詳見圖2。

由圖2A可知，因素X1與X2交互作用顯著，隨著X1增大，粒徑也隨之增大；由圖2B可知，因素X2與X3交互作用顯著，隨著X2的增大，粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢；由圖2C可知，因素X1與X2交互作用顯著，隨著X2的增大，載藥量逐漸減??；由圖2D可知，因素X1與X3交互作用顯著，隨著X1的增大，載藥量也逐漸減小。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

圖2 各因素對粒徑和載藥量影響的響應(yīng)面圖Fig 2 Response surface plots of each factor to particle size and drug-loading amount

2.4.4 最優(yōu)制備工藝的確定 基于Design-expert 8.0.6軟件對所建模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得最優(yōu)制備工藝為豆磷脂與藥物質(zhì)量比13.30∶1（mg/mg）、豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比4.09∶1（mg/mg）、超聲時間10 min，得到預(yù)測粒徑為196.3 nm，載藥量為10.68%。

2.4.5 驗證試驗 按上述最優(yōu)制備工藝進行驗證，平行制備3批DOX納米脂質(zhì)體，詳見表4、圖3。由表4、圖3可知，實測值與預(yù)測值一致性良好，提示優(yōu)化所得制備工藝簡單、可行，其粒徑符合正態(tài)分布。

表4 最優(yōu)制備工藝驗證結(jié)果Tab 4 Results of optimal preparation technology validation

2.5 DOX納米脂質(zhì)體的光熱轉(zhuǎn)換試驗

參考相關(guān)文獻進行DOX納米脂質(zhì)體的光熱轉(zhuǎn)換試驗[14］。取“2.1”項下DOX納米脂質(zhì)體，加水稀釋，制成納米硫化銅質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5 mg/mL的納米混懸液。分別取上述納米混懸液3 mL，置于石英比色池中，采用激光器（2.5 w/cm2）照射（激發(fā)波長:808 nm），每30 s記錄1次溫度隨時間的變化值，以水為對照組，以時間為橫坐標(biāo)、溫度為縱坐標(biāo)，采用OriginPro 8.5.1軟件繪制光熱轉(zhuǎn)換曲線，詳見圖4。

圖3 粒徑分布圖Fig 3 Distribution of particle size

圖4 光熱轉(zhuǎn)換曲線圖Fig 4 Light heat transformation curve plot

由圖4可知，含有納米硫化銅不同質(zhì)量濃度的DOX納米脂質(zhì)體在808 nm激光照射下，溫度可隨照射時間的延長明顯上升，濃度越高溫度上升越快。當(dāng)照射時間為8 min時，納米硫化銅質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5 mg/mL時的溫度分別為47.6、51.1、54.9℃，此時超純水溫度基本不變，維持在24.6℃。提示，DOX納米脂質(zhì)體具有濃度和時間依賴性的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，可結(jié)合近紅外激光照射進行PTT治療。

3 討論

本課題以親水性納米硫化銅為光熱轉(zhuǎn)換劑，采用薄膜分散法制備了DOX納米脂質(zhì)體，試驗中通過旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，可有效避免納米脂質(zhì)體中有機溶劑的殘留；此外磷脂易吸潮，在保存過程中應(yīng)注意避潮，可將其放入真空袋中以保持干燥性。DOX是一種需要避光保存的藥物[15］，研究過程中需注意避光操作，且制得的DOX納米脂質(zhì)體也應(yīng)避光保存。

本研究采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化了DOX納米脂質(zhì)體的制備工藝，優(yōu)化后的最佳工藝為豆磷脂與藥物質(zhì)量比13.30∶1（mg/mg）、豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比4.09∶1（mg/mg）、超聲時間10 min。按此優(yōu)化工藝所得DOX納米脂質(zhì)體的粒徑為（200.5±25.1）nm、載藥量為（11.02±0.20）%，該工藝簡單、可行。光熱轉(zhuǎn)換試驗結(jié)果顯示，DOX納米脂質(zhì)體具有濃度和時間依賴性的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，這可為近紅外光響應(yīng)性腫瘤靶向遞藥載體的進一步研究提供參考。

綜上所述，本研究所建含量測定方法簡便、準確度較好，優(yōu)化所得制備工藝簡單、可行。