王曉丹 陳 浩 張振乾 官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心/水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界目前已知的油菜病害有100多種，我國已發(fā)現(xiàn)30多種，包括真菌、病毒、細(xì)菌病害等[1]。其中菌核病[Sclerotiniasclerotiorum(L.)deBary]、病毒病(Turnipmosaicvirus)及霜霉病[Peronosporaparasitica(Pers.)Fr.]是我國油菜(BrassicanapusL.)三大主要病害，嚴(yán)重危害油菜產(chǎn)量[2-5]。研究表明，高油酸油菜品種具有油酸含量高、營養(yǎng)成分豐富等優(yōu)點(diǎn)，且具有很好的營養(yǎng)保健功能[6]。高油酸油菜已成為當(dāng)前油菜育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)，受到了國內(nèi)外研究者的高度重視[7]。但與常規(guī)油菜相比，高油酸油菜抗病性較差[8]，且關(guān)于高油酸油菜研究多集中于分子機(jī)理研究及新品種選育等方面[9-11]，對(duì)其抗病相關(guān)研究尚不常見。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)具可靠性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于不同作物的抗性基因表達(dá)與抗性相關(guān)性研究[12-14]。在油菜中，已有利用RT-qPCR技術(shù)在耐旱、脂肪酸合成等相關(guān)基因的表達(dá)及其與對(duì)應(yīng)的耐旱生理指標(biāo)、脂肪酸合成的相關(guān)性分析等的報(bào)道[15-16]，但關(guān)于抗病基因與抗病性關(guān)系的研究尚鮮見報(bào)道。

本研究以高油酸油菜近等基因系材料授粉后20～35 d種子為試驗(yàn)材料，進(jìn)行miRNA測序，得到與抗病相關(guān)差異miRNA的靶基因，即熱激蛋白90(heat shock proteins 90,HSP90)與自噬相關(guān)基因3(autophagy-related gene,ATG3)。HSP90在分子進(jìn)化上高度保守[17]，廣泛介導(dǎo)脅迫信號(hào)的傳遞、參與蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的折疊、蛋白復(fù)合體裝配和拆卸、激活底物等，在植物抗逆性中起著重要作用[18-19]。ATG3廣泛參與動(dòng)植物各種生物及非生物脅迫等[20-22]。本研究對(duì)HSP90和ATG3基因在甘藍(lán)型高油酸油菜中表達(dá)規(guī)律及相關(guān)材料病害調(diào)查進(jìn)行研究，旨在找出其內(nèi)在關(guān)聯(lián)，以期為高油酸油菜抗病材料篩選提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以20個(gè)(編號(hào)1～20)甘藍(lán)型高油酸油菜品系為試驗(yàn)材料[由國家油料改良中心(湖南分中心)提供]，采用7890B型氣相色譜儀(Agilent，USA)測定各品系脂肪酸成分(表1)。

試驗(yàn)于2017年10月-2018年5月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地進(jìn)行。每個(gè)小區(qū)面積10 m2，密度12萬株·hm-2，各設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 20個(gè)油菜品系脂肪酸成分組成Table 1 Fatty acid composition of 20 high oleic acid rapeseed /%

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病害調(diào)查 在高油酸油菜授粉后35 d對(duì)各個(gè)品系所有植株進(jìn)行病害調(diào)查(菌核病和病毒病)，分別統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)量，并進(jìn)行病情分級(jí)。其中，0級(jí)：整株無癥狀；1級(jí)：33.33%以下植株有病斑，受害角果低于25%；2級(jí)：整株33.33%～66.67%發(fā)病，受害角果數(shù)達(dá)25%～50%；3級(jí)：全株66.67%以上發(fā)病，受害角果數(shù)達(dá)50%～75%；4級(jí)：全株發(fā)病，絕收或極少角果。發(fā)病率和病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析參考劉勝毅[23]的方法。

1.2.2 RNA提取 分別取幼苗期、五～六葉期、蕾苔期和盛花期倒數(shù)第3片伸展葉，盛花期花蕾、盛開的花和即將凋謝的花混合，以及角果期自交授粉后15、25、35 d 的自交種子。每次取5株樣品，混合提取RNA，分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)(Thermo,USA) 檢測其質(zhì)量和濃度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-qPCR分析HSP90和ATG3引物通過Premier 6.0設(shè)計(jì)(表2)，Oligo 7.0檢測，由擎科生物技術(shù)有限公司(長沙)合成。用上述檢測合格的RNA按照TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)

表2 RT-qPCR引物及內(nèi)參基因序列Table 2 Sequences of primers and reference gene used for RT-qPCR

試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以劉芳等[24]設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)程序?qū)σ镞M(jìn)行檢測，按照TransScriptTip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，使用CFX96TM Real-Time System(BIORAD，USA)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)(兩步法)。以UBC9為內(nèi)參基因[25]，采用Pfaffl[26]的方法進(jìn)行基因表達(dá)情況評(píng)價(jià)。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查結(jié)果

對(duì)20個(gè)高油酸油菜品系的病害調(diào)查結(jié)果及病情指數(shù)和發(fā)病率進(jìn)行了分析，由表3可知，20個(gè)供試品系發(fā)病率在21%～88%之間，病情指數(shù)在0.12～0.57之間。品系1～10的病情指數(shù)(<0.3)和發(fā)病率(<35%)均較低，表明其抗性較強(qiáng)。對(duì)20個(gè)品系發(fā)病率與病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，二者呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)r=0.972 0(圖1)。

表3 病害調(diào)查結(jié)果Table 3 Disease survey results

2.2 HSP90基因表達(dá)分析及其與抗病指數(shù)間的關(guān)系

2.2.1HSP90基因表達(dá)分析 對(duì)20個(gè)高油酸油菜品系的HSP90基因在整個(gè)生育期中不同材料的表達(dá)量進(jìn)行分析，由圖2可知，除品系4、15、16外，其余品系隨著生育期的推進(jìn)，HSP基因的表達(dá)量逐漸降低，直至花期。花期-花與花期-葉表達(dá)量整體無顯著差異(P>0.05)。品系11、12、13、14、15、19、16、17、18在角果期-15 d自交種子中HSP90基因的表達(dá)量的表達(dá)量較低，在角果期-25 d自交種子中表達(dá)量升高后，在角果期-35 d自交種中表達(dá)量又降低，但仍高于角果期 -15 d自交種子中的表達(dá)量；品系4、5、9、1、8、2、7、3、10、6、20HSP90基因表達(dá)量則在整個(gè)角果期均呈逐漸增加的趨勢。角果期降雨量增加，植株密度增加，會(huì)加劇各種病害發(fā)生，尤其是菌核病[27]。HSP90基因作為抗脅迫相關(guān)基因，可能參與抵御菌核病侵襲的脅迫反應(yīng)。

圖1 高油酸油菜品系病情指數(shù)與發(fā)病率相關(guān)性分析Fig.1 Crrelation between disease index and morbidity in high oleic acid rapeseed strains

此外，蕾薹期-葉中品系4、5、9、1、8、7的HSP90基因表達(dá)量是內(nèi)參基因的1.50～3.05倍，但這6個(gè)品系病情指數(shù)均不大于0.16；而品系20、15、19、17的HSP90基因表達(dá)量僅為內(nèi)參基因的0.26～0.52倍，而病情指數(shù)介于0.34～0.57之間?；ㄆ?葉中4、1、8、7品系基因表達(dá)量是內(nèi)參基因的1.50～2.42倍，但病情指數(shù)均不大于0.16；而品系20、14、15、19、17基因表達(dá)量僅有內(nèi)參基因的0.19～0.42倍，但病情指數(shù)介于0.34～0.57之間。綜上表明，HSP90基因表達(dá)量≥1.5倍內(nèi)參時(shí)，材料抗病性較強(qiáng)。

注：20個(gè)品系按照角果期2種表達(dá)模式和病情指數(shù)大小進(jìn)行排序。下同。Note: The rank of 20 vaieties are according to two expression pattern at pod stage and the disease index ranges from small to large. The same as following.圖2 20個(gè)高油酸油菜品系中HSP90基因在整個(gè)生育期的表達(dá)量Fig.2 The expression of HSP90 in 20 high oleic acid rapeseeds at the whole growth stage

2.2.2HSP90基因表達(dá)量與抗病指數(shù)間的關(guān)系 對(duì)HSP90基因表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)間的關(guān)系進(jìn)行研究，由表3可知，在線性分析與非線性分析[28]中，蕾薹期-葉、花期-葉，以及角果期-15 d自交種子、角果期-25 d自交種子、角果期-35 d自交種子中均呈極顯著負(fù)相關(guān)，且除花期-葉，非線性相關(guān)性較線性相關(guān)性更高。

對(duì)HSP90基因表達(dá)規(guī)律和抗病指數(shù)間有顯著差異的材料進(jìn)行相關(guān)性擬合模型分析發(fā)現(xiàn)，總體上非線性函數(shù)R2較大，與表3結(jié)果一致，表明數(shù)據(jù)可靠[29](表4)。

表3 HSP90基因表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)相關(guān)性Table 3 Correlation between HSP90 gene expression pattern and disease resistance index

注：*與**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。下同。

Note:*and**indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level,respectively. The same as following.

2.3 ATG3基因表達(dá)量與抗病指數(shù)間的關(guān)系

2.3.1ATG3基因表達(dá)分析 對(duì)20個(gè)高油酸油菜品系的ATG3基因在整個(gè)生育期中不同材料表達(dá)量進(jìn)行分析，由圖3可知，與HSP90基因在整個(gè)苗期葉的表達(dá)規(guī)律相反，大多數(shù)品系在生長前期呈逐漸升高的趨勢直至花期。在花期-花與花期-葉的表達(dá)量之間無顯著差異(P>0.05)。在角果期AGT3基因的表達(dá)規(guī)律呈2種趨勢，品系4、11、20、13、14、15、19、16、17、18在角果期-15 d自交種子中表達(dá)量較低，在角果期-25 d自交種子中表達(dá)量升高，然后在角果期-35 d自交種子中表達(dá)量又降低；品系5、9、1、8、2、7、3、10、6、12的ATG3基因則在整個(gè)角果期呈逐漸升高的趨勢。

結(jié)合圖1與圖3，對(duì)ATG3基因在生長早期表達(dá)情況與病情指數(shù)有顯著差異的材料進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，五～六葉期-葉中，品系4、1、8、2、7基因表達(dá)量是內(nèi)參基因的1.85～4.45倍，但其病情指數(shù)均不大于0.16，反之品系12、11、19、18基因表達(dá)量僅內(nèi)參基因的1.11～1.28倍，而病情指數(shù)介于0.34～0.57?；ㄆ?葉中品系4、5、9、1、8、2、7病情指數(shù)介于0.12～0.16，但基因表達(dá)量為內(nèi)參基因的2.26～9.14倍；而品系13、14、19、17病情指數(shù)介于0.46～0.57之間，其基因表達(dá)量僅為內(nèi)參基因的1.19～1.79倍。表明，ATG3基因表達(dá)量≥1.8倍內(nèi)參基因時(shí)，材料抗病性較好。

2.3.2ATG3基因表達(dá)量與抗病指數(shù)間的相關(guān)性 對(duì)ATG3基因表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)間的關(guān)系進(jìn)行研究，由表5可知，與HSP90基因類似，在線性分析與非線性分析條件下，在五～六葉期-葉、花期-花、角果期-15 d自交種子、角果期-25 d自交種子、角果期-35 d自交種子中均達(dá)極顯著負(fù)相關(guān)，且非線性相關(guān)性更高(五～六葉期除外)。對(duì)有顯著差異的材料作進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，五～六葉期-葉、花期-花的4種擬合函數(shù)R2均較小(表6)，與表5結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

表5 ATG3基因表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)相關(guān)性Table 5 Correlation between ATG3 gene expression pattern and disease resistance index

表6 ATG3基因表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)間顯著差異材料相關(guān)性擬合模型Table 6 Correlation fitting model of significant difference material between ATG3 gene and disease index

2.4 HSP90與ATG3基因表達(dá)量與病害間的關(guān)系

分別選擇HSP90、ATG3基因與抗病指數(shù)有顯著或極顯著相關(guān)性的早期生育期，即HSP90選擇蕾薹期-葉和花期-葉，ATG3選擇五～六葉期-葉和花期-花進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，蕾薹期-葉中，有15個(gè)品系(除品系3、4、6、12、18)HSP90表達(dá)量與病情指數(shù)變規(guī)律相符，占總品系數(shù)的75%；花期-葉中有19個(gè)(除品系4)相符，占總品系數(shù)的95%，即用HSP90基因在花期-葉中表達(dá)量≥1.5倍內(nèi)參時(shí)進(jìn)行抗病品系篩選，有95%的準(zhǔn)確性；ATG3基因在五～六葉期-葉與花期-花中，均有16個(gè)品系(前者除品系3、4、9、16，后者除品系1、4、7、10)的ATG3基因表達(dá)量與病情指數(shù)變規(guī)律相符，占總品系數(shù)的80%，即用ATG3基因在五～六葉期-葉或花期-葉中表達(dá)量≥1.8倍內(nèi)參時(shí)進(jìn)行抗病材料篩選，均有80%的準(zhǔn)確性,因油菜花較難提取RNA，同時(shí)五～六葉期-葉在油菜生長發(fā)育前期，因而可選擇五～六葉期-葉進(jìn)行篩選。

3 討論

大量研究表明，HSP90和ATG3基因在植物抗逆性中起著重要作用[17-22]。本研究對(duì)HSP90和ATG3基因在20個(gè)不同甘藍(lán)型高油酸油菜品系不同生育期材料中表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)二者在花期-葉與花期-花中的表達(dá)量均無顯著差異，其原因可能與花期營養(yǎng)生長與生殖生長均較旺盛相關(guān)[30]。而在角果期，二者均呈2種表達(dá)趨勢，即逐漸升高和先升高后降低趨勢，表明基因表達(dá)可能與不同材料有關(guān)，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，角果期是病害高發(fā)期[27]，本研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)角果期HSP90和ATG3表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)性，驗(yàn)證了其抗病功能，與前人研究一致。

研究表明，利用抗病基因篩選抗病材料或進(jìn)行病害防治能極大縮短時(shí)間，降低成本[31-32]。如Niu等[12]通過RT-qPCR驗(yàn)證了9個(gè)抗病相關(guān)基因與小麥白粉病抗性相關(guān)，且其中8個(gè)基因與小麥白粉病抗性呈正相關(guān)；黃啟秀等[13]以7種海島棉為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)其枯萎病抗性與類黃酮代謝途徑基因CHI和DFR表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)性；谷曉娜等[14]以轉(zhuǎn)基因大豆N29-705-15和JL30-187為試驗(yàn)材料，利用RT-qPCR技術(shù)檢測了hrpZpsta基因在轉(zhuǎn)基因大豆不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明hrpZpsta基因在大豆植株中的表達(dá)量與受體植株對(duì)疫霉根腐病和灰斑病抗性存在一定的相關(guān)性。Barkley等[33-34]利用RT-qPCR方法，對(duì)高油酸花生及其野生型種子和葉片中的差異ahFAD2B基因進(jìn)行檢測，快速區(qū)分了野生型和突變型，并進(jìn)一步確定了ahFAD2A的不同突變類型；杜建中等[35]研究RDVMP基因在轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米的遺傳、表達(dá)及抗病性，結(jié)果顯示該基因的表達(dá)量與轉(zhuǎn)化株系的抗病性顯著相關(guān)。本研究通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)高油酸油菜抗病基因HSP90與ATG3分別在蕾薹期-葉、花期-葉與五～六葉期-葉、花期-花中的表達(dá)量與抗病指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，且兩兩之間符合度均較高(60%～80%)。尤其是HSP90在花期-葉中表達(dá)量與ATG3在五～六葉期-葉表達(dá)量，符合度最高，可用于高油酸油菜抗病材料的早期篩選。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，HSP90基因在整個(gè)苗期表達(dá)量逐漸降低，ATG3基因則在苗期表達(dá)量逐漸升高，而角果期二者均呈2種表達(dá)趨勢，即逐漸升高和先升高后降低趨勢，表明基因表達(dá)可能與材料不同有關(guān)，可增加樣本量進(jìn)一步檢測并開展相關(guān)基因后續(xù)功能驗(yàn)證。發(fā)病率與病情指數(shù)相關(guān)性分析表明，油菜角果期HSP90和ATG3基因的表達(dá)規(guī)律與抗病指數(shù)之間呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)性。綜合兩基因表達(dá)情況結(jié)合病情指數(shù)分析可知，HSP90在花期-葉(95%)中表達(dá)情況與ATG3在五～六葉期-葉(80%)、花期-花(80%)中表達(dá)情況可用于高油酸油菜育種材料抗病性預(yù)測。本研究結(jié)果為高油酸油菜抗病材料的早期篩選和促進(jìn)高油酸油菜育種研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。