俞子承 倪 飛 江 成 黃華宏 林二培 童再康

(浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 311300)

木質(zhì)素是由多種不同的木質(zhì)素單體氧化偶聯(lián)形成的異質(zhì)性細(xì)胞聚合物，為植物次生壁主要成分，在木本植物中約占13%～35%，在植物體機(jī)械支撐、水分輸送、抵御外界侵襲等方面起著重要的作用[1]。被子植物木質(zhì)素單體的生物合成過程十分復(fù)雜，參與木質(zhì)素生物合成途徑的相關(guān)酶類也較多[2-3]。其中咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase，CCoAOMT)是甲基化反應(yīng)的重要酶類，能夠催化咖啡酰輔酶A生成阿魏酰輔酶A，且在整個木質(zhì)化過程發(fā)揮作用[4-6]。木質(zhì)素以其堅固、穩(wěn)定和難以分解的特質(zhì)，廣泛應(yīng)用于建筑、軍工等行業(yè)，目前已有關(guān)于木質(zhì)素合成的分子機(jī)制、調(diào)控木質(zhì)素的生物合成、改變木質(zhì)素的組成結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究報道，如Do等[7]通過T-DNA插入突變的方法抑制了擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCCoAOMT1基因的表達(dá)，獲得缺陷植株的木質(zhì)素含量較對照降低約26%。Li等[8]發(fā)現(xiàn)下調(diào)玉米(Zeamays)ZmCCoAOMT1基因表達(dá)的缺陷植株與野生型相比，木質(zhì)素含量下降了22.4%，纖維素含量增加了23.3%。Zhong等[9]研究發(fā)現(xiàn)CCoAOMT是雜交楊(Populustremula×P.alba)木質(zhì)素合成中的關(guān)鍵酶之一，通過反義抑制其編碼基因的表達(dá)，會導(dǎo)致總木質(zhì)素含量顯著下降。此外，研究表明調(diào)控CCoAOMT基因的表達(dá)能夠影響木質(zhì)素單體的比例，改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[10-11]。因此，CCoAOMT基因的研究價值和應(yīng)用前景極高。

光皮樺(Betulaluminifera)又名亮葉樺，是我國特有的速生用材樹種，主要分布于我國南方地區(qū)，其材質(zhì)優(yōu)良，在航空、建筑、家具、造紙等行業(yè)應(yīng)用廣泛，已被多省列為優(yōu)選推廣的珍貴樹種，且被國家列入戰(zhàn)略儲備樹種[12]。近年來，浙江農(nóng)林大學(xué)黃華宏課題組相繼對4CL、OFP、KNOX等多個關(guān)鍵基因家族的序列、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究，并初步了解了它們在木質(zhì)素生物合成中的作用[13-15]，但尚未對CCoAOMT編碼基因進(jìn)行系統(tǒng)研究。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因組水平上，單個核苷酸變異所造成的序列多態(tài)性。SNP具有數(shù)量多、分布廣等特點(diǎn)。趙宏亮等[16]在水稻(Oryzasativa)的12條染色體上檢測到的 6 704個SNP變異位點(diǎn)，幾乎分布于整個基因組中。來自功能基因中的一些SNP位點(diǎn)與目標(biāo)性狀變異有重要的關(guān)聯(lián)。如鞏琛銳等[17]研究表明毛白楊(Populustomentosa)S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA在不同基因型中存在豐富的SNP變異，其中3個SNP位點(diǎn)與木材品質(zhì)性狀(纖維長度和微纖絲角)顯著關(guān)聯(lián)，可作為優(yōu)良木材品質(zhì)性狀早期選擇的重要標(biāo)記。因此，開展目標(biāo)性狀候選基因內(nèi)SNPs的發(fā)掘和關(guān)聯(lián)分析，可為深入解析基因功能提供依據(jù)[18]。

本研究以不同來源的光皮樺為材料，分離BlCCoAOMT基因序列，進(jìn)行序列特征、組織表達(dá)特異性分析，開展該基因的SNP變異分析，以期為深入解析該基因功能和分子標(biāo)記輔助育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以2年生光皮樺LA0406無性系為試驗材料，盆栽于浙江農(nóng)林大學(xué)良種基地溫室內(nèi)，氣溫控制在20～28℃之間。共采集根、葉芽、幼葉、雌花序、雄花序，以及不同木質(zhì)化莖段等10種器官或組織，采樣時間為4月初至5月底。莖取自當(dāng)年生枝條，從頂端向下依次截取第1、第2、第3、第5和第7節(jié)間，分別標(biāo)為Internode 1、Internode 2、Internode 3、Internode 5和Internode 7，經(jīng)解剖觀測第1、第2節(jié)莖段的木質(zhì)化區(qū)域很少，第3、第5和第7節(jié)莖的木質(zhì)部比例較高[14]；葉(leaf)取自2個不同發(fā)育時期，分別為葉芽(leaf bud)、幼葉(young leaves)，標(biāo)為leaf 1、leaf 2；雄花(male inflorescence)、雌花(female inflorescence)均取自樹冠中上部；根(root)取自該無性系的水培植株。應(yīng)拉木誘導(dǎo)處理參照何輝等[19]的方法，將生長相對一致2年生植株拉彎處理，分別在處理6 h、48 h、7 d時，刮取應(yīng)拉木(tension wood)和對應(yīng)木(opposite wood)發(fā)育木質(zhì)部，同時取直立植株相同高度的木質(zhì)部作為對照(CK)。每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。所有樣品經(jīng)液氮速凍后，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

分別從福建尤溪、廣西龍勝花坪自然保護(hù)區(qū)、江西龍南九連山和浙江臨安太湖源4個光皮樺群體共采集73個植株的葉片，具體采集方法參照張俊紅等[20]的報道。提取的葉片DNA用于BlCCoAOMT基因內(nèi)SNP分析。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改良CTAB法[15]提取光皮樺葉片基因組總DNA。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 參照PureLinkTMPlant RNA Reagent試劑(美國Thermo Fisher公司)說明書提取不同組織的RNA。cDNA第一鏈的合成按照TaKaRa(日本)公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進(jìn)行。

1.2.3BlCCoAOMT基因的分離 基于光皮樺轉(zhuǎn)錄組測序庫中CCoAOMT基因片段設(shè)計5′和3′RACE引物(GSP1和GSP2)[12]，配合通用引物UPM，采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(ClonTech公司，美國)進(jìn)行RACE的擴(kuò)增。將獲得的目的片段，通過美國TransGen公司的pEASY-T1 Simple Cloning Kit進(jìn)行載體連接，隨后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌菌株[TaKaRa(日本)公司]。采用PCR方法鑒定陽性重組子后送南京金斯瑞公司測序，拼接得到BlCCoAOMT基因序列全長。進(jìn)一步在5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)設(shè)計引物進(jìn)行PCR和克隆測序以驗證其正確性。相關(guān)引物序列見表1。

表1 本試驗所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用DNASTAR軟件中的EditSeq確定開放閱讀框(open reading frame，ORF)和預(yù)測氨基酸序列、分子量(kDa)及等電點(diǎn)(pI)。利用Clustal X2軟件對CCoAOMT蛋白序列進(jìn)行多序列比對。用MEGA7.0軟件構(gòu)建不同植物的CCoAOMT蛋白的進(jìn)化樹，分析進(jìn)化關(guān)系[21]。采用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(GSDS，http://gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.5 基因表達(dá)分析 根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒[TaKaRa(日本)公司]操作按照說明書將光皮樺RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)熒光定量PCR試劑盒[TaKaRa(日本)公司]分析BlCCoAOMT基因在各器官或組織中，以及應(yīng)拉木形成早期階段的表達(dá)情況。以BlActin作為定量PCR內(nèi)參基因，相關(guān)引物序列詳見表1。

1.2.6 SNP多樣性分析 以來自4個群體的73個不同基因型植株DNA為模板，采用全長驗證引物(full-length RT-PCR)、高保真Taq酶(TransGen公司，美國)進(jìn)行PCR；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，連接pEASY-Blunt Simple Vector載體(TransGen公司，美國)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；通過PCR篩選出陽性克隆，送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。利用DnaSP 6.10軟件[22]對BlCCoAOMT基因序列SNP位點(diǎn)分布、轉(zhuǎn)換和顛換的數(shù)量，以及同義突變、錯義突變和無義突變情況等進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BlCCoAOMT基因的克隆及序列分析

獲得的BlCCoAOMT(GenBank注冊號為FJ410449)cDNA全長為1 114 bp，含有一個744 bp的完整ORF。編碼蛋白由247個氨基酸組成，相應(yīng)分子量為27.8 kDa、理論pI為5.42。多序列比對顯示，光皮樺BlCCoAOMT與白樺(Betulaplatyphylla)BpCCoAOMT相似度最高，二者核酸序列的一致性為95.9%，編碼蛋白氨基酸序列一致性為98.4%。進(jìn)一步擴(kuò)增BlCCoAOMT基因組序列，發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)被4個內(nèi)含子分割(圖1)。將其基因組序列與對應(yīng)的毛果楊(Populustrichocarpa)PtrCCoAOMT1基因組序列進(jìn)行同源性比較(表2)，結(jié)果表明BlCCoAOMT與PtrCCoAOMT1編碼區(qū)所覆蓋的基因組總長度分別為 1 391 bp和1 227 bp，二者具有相同的基因結(jié)構(gòu)，即含有5個外顯子和4個內(nèi)含子。這2個基因?qū)?yīng)外顯子的堿基數(shù)完全相同，但內(nèi)含子區(qū)域差異明顯。進(jìn)一步對這2個物種CCoAOMT基因內(nèi)部的外顯子和內(nèi)含子的同源性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BlCCoAOMT與PtrCCoAOMT1的外顯子相似性均在80%以上，而內(nèi)含子的相似性介于40.2%～54.5%之間。

注：黑色方框、黑色線條分別代表外顯子和內(nèi)含子。Note: The black boxes and black lines represent exons and introns, respectively.圖1 光皮樺CCoAOMT基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The gene structure of the CCoAOMT in B.luminifera

表2 光皮樺CCoAOMT和毛果楊CCoAOMT1基因組DNA結(jié)構(gòu)比較Table 2 Comparison of genomic DNA structures of CCoAOMT gene in B. luminifera and P. trichocarpa

注：“-”表示無數(shù)據(jù)。

Note: ‘-’ means no data.

2.2 BlCCoAOMT氨基酸序列比較及進(jìn)化分析

由圖2可知，BlCCoAOMT氨基酸序列包含CCoAOMT序列中所有的保守元件，其中A、B、C為植物甲基轉(zhuǎn)移酶中普遍存在的保守序列元件，通常認(rèn)為這3個元件并非底物的特異結(jié)合位點(diǎn)，而與甲基供體SAM的結(jié)合有關(guān)。D、E、F、G、H為CCoAOMT所特有的標(biāo)簽序列[23]。

由圖3可知，CCoAOMT可被分為4個亞類，其中BlCCoAOMT與白樺BpCCoAOMT、毛果楊PtrCCoAOMT1和PtrCCoAOMT2、毛白楊PtCCoAOMT、擬南芥AtCCoAOMT1，以及煙草(Nicotianatabacum)NtCCoAOMT1序列相似，聚在第一亞類。毛果楊PtrCCoAOMT3、PtrCCoAOMT4和PtrCCoAOMT5，以及擬南芥AtCCoAOMT2、AtCCoAOMT3、AtCCoAOMT4、AtCCoAOMT5、AtCCoAOMT6和AtCCoAOMT7分屬其他三個亞類。

注：At：擬南芥；Bl：光皮樺；Bp：白樺；Bpa：構(gòu)樹；Ej：枇杷；Gh：陸地棉；Ptr：毛果楊；下劃線(A-H)：保守序列元件。Note: At: Arabidopsis thaliana. Bl: Betula luminifera. Bp: Betula platyphylla. Bpa: Broussonetia papyrifera. Ej: Eriobotrya japonica. Gh: Gossypium hirsutum. Ptr: Populus trichocarpa. Underline(A-H): Conserved sequence elements.圖2 光皮樺BlCCoAOMT與同源蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of BlCCoAOMT with homologous proteins

2.3 BlCCoAOMT基因表達(dá)分析

由圖4可知，BlCCoAOMT在第3節(jié)、第5節(jié)、第7節(jié)莖段表達(dá)量均顯著高于其他組織，且第7節(jié)莖段中表達(dá)量最高(5.930)，在第1節(jié)、第2節(jié)莖段中表達(dá)量均較低，分別為0.922和1.437，在根、雌花中的表達(dá)量均與幼葉差異顯著，且在葉芽中的表達(dá)量最低(0.518)，表明BlCCoAOMT基因可能與其木質(zhì)化有關(guān)。

應(yīng)拉木是指在外力作用下造成的彎曲樹干或樹枝試圖恢復(fù)到原來位置，所形成的解剖、物理力學(xué)性質(zhì)明顯不同的木材[24-25]。在光皮樺中，拉彎處理會使應(yīng)拉木的細(xì)胞壁明顯增厚，平均纖維長度增加、纖維素含量增加，以及木質(zhì)素含量下降[13]。由圖5可知，與直立木(CK)相比，拉彎處理早期階段應(yīng)拉木(TW)中BlCCoAOMT基因的表達(dá)量呈下降趨勢，且相應(yīng)數(shù)值皆顯著低于CK；在對應(yīng)木(OW)中的表達(dá)量則是先下降后上升，拉彎7 d時恢復(fù)到CK水平。

2.4 BlCCoAOMT基因SNP多樣性分析

由表3可知，在1 651 bp長度的BlCCoAOMT基因片段中出現(xiàn)了3次插入和4次缺失的突變，且均發(fā)生在非編碼區(qū)，同時檢測到119個SNPs，其中單變異位點(diǎn)(singleton variable sites)10個，簡約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)109個(含12個三態(tài)SNP位點(diǎn))，平均每14 bp就有1個SNP位點(diǎn)。由表4可知，在5′非翻譯區(qū)、外顯子、內(nèi)含子、3′非翻譯區(qū)分別檢測到4、26、80、9個SNPs，SNP位點(diǎn)數(shù)與堿基對數(shù)比例分別為5.6%、3.4%、12.5%、7.7%，其中8個保守元件對應(yīng)區(qū)域存在18個SNPs。進(jìn)一步對檢測到的107個二態(tài)SNPs進(jìn)行變異類型統(tǒng)計，其中62個屬于轉(zhuǎn)換，45個屬于顛換(表5)。

進(jìn)一步對編碼區(qū)內(nèi)檢測到的26個SNPs進(jìn)行了突變類型分析，以確認(rèn)BlCCoAOMT基因編碼區(qū)的SNPs是否引起編碼氨基酸的改變。由表6可知，在26個SNPs位點(diǎn)上，同義突變的有21個，其中8個保守元件對應(yīng)區(qū)域有16個；錯義突變的5個，其中2個在保守元件D的對應(yīng)序列上；不存在無義突變。全部的5個錯義突變位點(diǎn)共引起5種氨基酸改變。突變位于密碼子第1個核苷酸位點(diǎn)的有3個，即在編碼區(qū)第135位密碼子改變，由GGC突變?yōu)锳GC，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)榻z氨酸(Ser)；第302位密碼子改變，由TCC突變?yōu)镃CC，氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榻z氨酸(Ser)；第320位密碼子改變，由AAG突變?yōu)镚AG，氨基酸由賴氨酸(Lys)變?yōu)楣劝彼?Glu)。而位于第2個和第3個核苷酸的位點(diǎn)各有1個。

注：At：擬南芥(AT4G34050；At1g24735；At3g61990；At3g62000；At1g67990；At1g67980；At4g26220)；Bl：光皮樺(FJ410449)；Bp：白樺(KT223488)；Bpa：構(gòu)樹(AY579076)；Ej：枇杷(JX885583)；Gh：陸地棉(FJ376606)；Nt：煙草(U38612)；Pto：毛白楊(EU760389)；Ptr：毛果楊 (649581；829835；837287；805093；820698；755509)；Zm：玉米(NM_001320647；AJ242981)。Note: At: Arabidopsis thaliana(AT4G34050; At1g24735; At3g61990; At3g62000; At1g67990; At1g67980; At4g26220). Bl: Betula luminifera(FJ410449). Bp: Betula platyphylla(KT223488). Bpa: Broussonetia papyrifera(AY579076). Ej: Eriobotrya japonica(JX885583). Gh: Gossypium hirsutum(FJ376606). Nt: Nicotiana tabacum(U38612). Pto: Populus tomentosa(EU760389). Ptr: Populus trichocarpa(649581; 829835; 837287; 805093; 820698; 755509). Zm: Zea mays(NM_001320647; AJ242981).圖3 光皮樺CoAOMT蛋白與其他植物CCoAOMT的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of BlCCoAOMT and other related species CCoAOMT protein

表3 光皮樺BlCCoAOMT基因組序列中的插入和缺失情況Table 3 Summary of insertion and deletion in BlCCoAOMT gene sequence

表4 在BlCCoAOMT基因不同區(qū)域SNP數(shù)量及頻率Table 4 Number and frequency of SNPs in different regions of BlCCoAOMT

表5 BlCCoAOMT基因內(nèi)部SNP的替代類型Table 5 The substitution types of SNPs for BlCCoAOMT

注：Root：根；Internode 1：第1節(jié)間；Internode 2：第2節(jié)間；Internode 3：第3節(jié)間；Internode 5：第5節(jié)間；Internode 7：第7節(jié)間；Leaf 1：葉芽；Leaf 2：幼葉；FC：雌花；MC：雄花。以Root為參照，不同小寫字母 表示在0.05水平差異顯著。Note: Root: Root. Internode 1: The first internode. Internode 2: The second internode. Internode 3: The third internode. Internode 5: The fifth internode. Internode 7: The seventh internode. Leaf 1: Leaf bud. Leaf 2: Young leaves. FC: Female inflorescence. MC: Male inflorescence. Root was used as a reference, the different small letters indicate significant difference at 0.05 level.圖4 不同器官和組織中BlCCoAOMT基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of BlCCoAOMT in different organs and tissues

注：OW：對應(yīng)木；TW：應(yīng)拉木；CK：對照組。*表示在0.05水平差異顯著。Note: OW: Opposite wood. TW: Tension wood. CK: The controls. * indicates significant difference at 0.05 level.圖5 應(yīng)拉木形成中BlCCoAOMT基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of BlCCoAOMT during the formation of tension wood

2.5 不同群體內(nèi)BlCCoAOMT的遺傳分化特征

核苷酸多樣性是衡量一個群體之中遺傳多樣性的重要參數(shù)。多樣性數(shù)值越小，代表著群體的多樣性程度越低[26]。由表7可知，利用119個SNP位點(diǎn)計算得到多樣性指數(shù)πtot、πsil、πs、πn，顯示這些參數(shù)在4個群體間都存在一定差異，但均未達(dá)到顯著水平，表明在不同群體間BlCCoAOMT基因的分化程度無顯著差異。所有4個群體的非同義突變多樣性指數(shù)πn均小于同義突變πs，說明在光皮樺的進(jìn)化過程中，BlCCoAOMT基因主要受到純化的選擇壓力。利用DnaSP 5.0軟件對4個群體進(jìn)行了Tajima′s D和Fu and Li′s D的中性檢驗，發(fā)現(xiàn)福建尤溪、廣西龍勝和江西龍南3個群體Tajima′s D均為負(fù)值，表明這些群體中存在較多低頻率的等位基因，僅浙江臨安群體Tajima′s D為正值，暗示中等頻率的等位基因占主導(dǎo)。福建尤溪和廣西龍勝2個群體Fu and Li′s D均為負(fù)值，表明進(jìn)化過程中存在較多變異，多樣性豐富；而江西龍南和浙江臨安為正值，表明進(jìn)化過程中，正向選擇占主導(dǎo)地位[27-28]。

表7 BlCCoAOMT基因在群體內(nèi)的核苷酸變異Table 7 Summary of nucleotide variation in 4 populations for BlCCoAOMT

注：πtot：整個基因區(qū)域單核苷酸多樣性；πsil：非翻譯區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多樣性；πs：編碼區(qū)同義突變單核苷酸多樣性；πn：編碼區(qū)內(nèi)非同義突變多樣性。Tajima′s D和Fu and Li′s D為兩種不同檢驗中性進(jìn)化的方法得到的D值。

Note: πtot: Average nucleotide diversity in full gene. πsil: Average nucleotide diversity in untranslated regions and introns. πs: Average nucleotide diversity of synonymous mutation. πn:Average nucleotide diversity of non-synonymous mutation. Tajima′s D and Fu and Li′s D are D values calculated by the two neutral evolution test.

3 討論

CCoAOMT是調(diào)控植物苯丙烷類物質(zhì)合成的重要基因，多以基因家族的形式存在，如擬南芥和毛果楊基因組中分別含7個和6個CCoAOMT成員。本研究從光皮樺中克隆到1個BlCCoAOMT的cDNA序列，編碼蛋白包含植物CCoAOMT應(yīng)有的8個保守序列，且相應(yīng)基因組序列中含有5個外顯子。植物CCoAOMT可分為4個亞類，不同亞類的基因結(jié)構(gòu)不同，屬Ⅰ-Ⅲ亞類的CCoAOMT含5個外顯子，Ⅳ亞類的則含9個外顯子，與Tsai等[29]研究結(jié)果一致。BlCCoAOMT的基因組序列中含5個外顯子，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與擬南芥AtCCoAOMT1、煙草NtCCoAOMT1、毛白楊PtCCoAOMT聚為一類。AtCCoAOMT1主要在花序莖和根的維管組織中高度表達(dá)，該基因缺失突變體的主莖纖細(xì)并伴有木質(zhì)部塌陷的現(xiàn)象，木質(zhì)素含量明顯低于對照[7]。NtCCoAOMT1在木質(zhì)素的生物合成中發(fā)揮重要作用，主要在根和木質(zhì)化程度較高的莖段中表達(dá)[30]。趙華燕[31]發(fā)現(xiàn)PtoCCoAOMT主要在莖及發(fā)育的木質(zhì)部中表達(dá)，通過反義RNA技術(shù)下調(diào)該基因表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植株木質(zhì)素含量降低。本研究發(fā)現(xiàn)BlCCoAOMT在木質(zhì)化莖段中優(yōu)勢表達(dá)，且具有隨木質(zhì)化程度提高而增強(qiáng)的趨勢，在拉彎處理早期階段，該基因在應(yīng)拉區(qū)發(fā)育木質(zhì)部中的表達(dá)呈顯著下調(diào)，與應(yīng)拉木木質(zhì)素含量的下降相符。因此，推測BlCCoAOMT基因參與光皮樺木質(zhì)素的生物合成。

以來自4個群體的73個不同基因型植株為材料，共檢測到BlCCoAOMT基因組序列中存在119個SNPs位點(diǎn)，SNP位點(diǎn)數(shù)與堿基對數(shù)的比值為0.071，高于光皮樺BlSPL1基因[32](比值為0.038)，毛白楊PtCesA4基因[33](比值為0.029)和竹類植物Dwarf14基因[34](比值為0.045)。可見，該基因SNP變異豐富，其與個體木質(zhì)素含量間的關(guān)系值得深入研究。在這些SNP變異位點(diǎn)中，位于編碼區(qū)和兩側(cè)非翻譯區(qū)的SNPs變異頻率遠(yuǎn)低于內(nèi)含子區(qū)域，表明這些區(qū)域受到了較強(qiáng)的選擇壓力，發(fā)生在編碼區(qū)內(nèi)的非同義突變與同義突變的比率為0.24<1，顯示在光皮樺演化過程中受到了純化選擇壓力[35]。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，且多為C→T，與毛白楊和小葉楊部分基因的研究結(jié)果類似[36]，其原因可能是CG中C(胞嘧啶)易發(fā)生甲基化、自發(fā)地脫氨轉(zhuǎn)換成T(胸腺嘧啶)相關(guān)。雖然不同群體間BlCCoAOMT基因的分化程度無顯著差異，但在福建尤溪和廣西龍勝2個群體中，BlCCoAOMT基因在進(jìn)化中存在較多的低頻率SNPs，這可能是由于在這2個群體SNPs中受到負(fù)選擇作用而保持較低的比例[35]。

基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析是目前開展林木分子輔助育種研究的重要策略之一。近年來關(guān)于黑楊(Populusnigra)、毛白楊、輻射松(Pinusradiata)等樹種的相關(guān)研究已挖掘出一批與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，并有望在育種實踐中發(fā)揮作用[37-39]。本研究推測BlCCoAOMT基因參與光樺木質(zhì)素生物合成，并發(fā)現(xiàn)該基因存在有豐富的SNP變異，為下一步通過關(guān)聯(lián)分析解析該基因SNPs位點(diǎn)與個體木質(zhì)素含量間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從光皮樺樹中克隆的1個BlCCoAOMT基因，編碼蛋白具CCoAOMT酶所有的8個典型保守基序；BlCCoAOMT主要在木質(zhì)化莖段中表達(dá)，且隨木質(zhì)化程度提高而增強(qiáng)；拉彎處理能抑制BlCCoAOMT在應(yīng)拉區(qū)發(fā)育木質(zhì)部中的表達(dá)，推測該基因參與光皮樺木質(zhì)素的生物合成。BlCCoAOMT基因序列中存在4個內(nèi)含子，在檢測個體中存在豐富SNP變異，外顯子區(qū)SNP的變化特點(diǎn)暗示該基因在光皮樺演化進(jìn)程中主要受到了純化選擇壓力。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明BlCCoAOMT基因SNP變異與木質(zhì)素含量間的關(guān)系，以及分子輔助木材品質(zhì)改良提供了理論支撐。