鐘 敏 陶俊杰 黃春輝 黃 清 鄒梁峰 廖光聯(lián) 陳 璐 徐小彪1,,*

(1 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西 南昌 330045；2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獼猴桃研究所，江西 南昌 330045)

毛花獼猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)雌雄異株的多年生藤本果樹，是我國特有的獼猴桃種質(zhì)資源，主要分布于長江以南海拔200～1 000 m的山區(qū)[1]。目前世界獼猴桃的主栽品種比較單一，培育新的栽培品種具有重要意義[2]。毛花獼猴桃具有抗逆性強、果實維生素C含量高且含有豐富的礦物質(zhì)等優(yōu)勢，已成為獼猴桃新品種選育的重要潛在物種[3]。目前已報道的毛花獼猴桃雌性品種有大果型沙農(nóng)18號[4]、華特[5]和易剝皮型品種贛獼6號[6]。

目前，獼猴桃雌株的研究主要集中在果實發(fā)育特性[7]、果實品質(zhì)[8]、果實采后特性[9]等方面，其中針對雄花花粉活力[12-13]、花粉形態(tài)[14]等的研究報道較多，但有關(guān)雄性種質(zhì)資源的報道較少。獼猴桃具有花粉直感效應(yīng)[10-11]，雄株所產(chǎn)花粉對果實的外觀和內(nèi)在品質(zhì)影響較大。當(dāng)前，我國獼猴桃授粉雄株的選育工作嚴(yán)重滯后，綜合性狀優(yōu)良并與雌株相配套的雄性品種較缺乏[15]。研究表明，從野生資源中選擇優(yōu)異品種較雜交育種耗時短且見效快，因此對野生資源的調(diào)查、評價和保存具有重要意義[16]。

SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記因其共顯性遺傳、分布廣、穩(wěn)定性和重復(fù)性好[17]等優(yōu)點，已成為理想的遺傳標(biāo)記技術(shù)，在藜麥[18]、綠豆[19]、蘋果[20]、杜梨[21]、牛心柿[22]、毛櫻桃[23]上均有報道。在分子水平上分析遺傳多樣性，可為種質(zhì)資源鑒定和品種鑒定提供依據(jù)，有利于獼猴桃種質(zhì)資源的開發(fā)利用。SSR技術(shù)在獼猴桃上的應(yīng)用集中于遺傳多樣性[2]、親緣關(guān)系鑒定[24]、關(guān)聯(lián)分析[25]及指紋圖譜鑒定[26]等方面，對野生獼猴桃雄性種質(zhì)資源群體的遺傳多樣性研究尚未見報道。江西是毛花獼猴桃的主產(chǎn)地之一，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獼猴桃研究團隊從2009年開始對江西省境內(nèi)的毛花獼猴桃進行種質(zhì)資源調(diào)查、收集，發(fā)現(xiàn)多個野生毛花獼猴桃雄性群體，并從中挖掘出觀賞和授粉兼用型優(yōu)株MG-15[27]。本研究通過對江西麻姑山、廬山、武功山、井岡山和南源山等地區(qū)的野生毛花獼猴桃雄株進行實地考察和樣品采集，利用15對SSR引物對其遺傳多樣性進行分析，以期為毛花獼猴桃雄性品種選育，挖掘優(yōu)異等位基因提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獼猴桃研究團隊2009-2015年調(diào)查江西省境內(nèi)野生毛花獼猴桃資源的基礎(chǔ)上，于2016年4-6月對集中分布區(qū)于麻姑山、廬山、武功山、井岡山和南源山5個野生毛花獼猴桃雄性群體共72個樣品進行取樣(表1)。按照均勻分布、隨機采樣的原則，選擇成齡毛花獼猴桃雄性單株，樣本間距離大于50 m，對規(guī)模較少的群體(如廬山)采集所發(fā)現(xiàn)的全部樣本。采集野生毛花獼猴桃個體的新鮮嫩葉，用有色硅膠迅速脫水干燥，常溫保存，用于DNA提取。

表1 野生毛花獼猴桃群體采樣信息Table 1 Sample information for each population of wild Actinidia eriantha

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 選用改良的CTAB法[28]提取野生毛花獼猴桃葉片基因組DNA；采用1%瓊脂糖凝膠對DNA質(zhì)量進行檢測，將提取的DNA樣品于 -20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR擴增 從80對SSR引物篩選出15對多態(tài)性較好的SSR引物(表2)進行擴增。擴增體系為10 μL，包含2×Taq PCR Mix[天根生化科技(北京)有限公司]5 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 2.4 μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，52～62℃退火30 s，72℃延伸30 s，28～34個循環(huán)；72℃終延伸10 min，12℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用8%的非變性PAGE電泳，快速銀染法檢測并拍照記錄[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以 DNA marker 作對照，拍照記錄并統(tǒng)計清晰的SSR條帶，從小到大依次記為A、B、C…，應(yīng)用POPGENE Ⅴ. 1.32 軟件計算各居群等位基因數(shù)(number of alleles，Na)、Shannon信息指數(shù)(Shannon′s information index，Ⅰ)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù)(Nei′s gene diversity)、觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、預(yù)期雜合度(expected heterozygosity，He)、多態(tài)位點比率(proportion of polymorphic loci，PPL)等遺傳多樣性指標(biāo)?；贜ei′s遺傳距離，利用NTSYS-pc2.10軟件對各毛花獼猴桃群體進行聚類分析，使用SPSS軟件對群體間的地理距離與遺傳距離進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛花獼猴桃SSR位點多態(tài)性和群體遺傳多樣性分析

從80對SSR引物中篩選出15對引物(表2)，能擴增出條帶清晰、穩(wěn)定性和多態(tài)性較好的條帶(圖1)。由表2、3可知，15對SSR引物在72份樣品的擴增位點上，共檢出86個等位基因，平均每對引物擴增出等位基因數(shù)為5.733，擴增產(chǎn)物片段介于100～300 bp之間。每對引物擴增有效等位基因數(shù)介于1.043～8.062之間，均值為3.002，多態(tài)性位點百分率為100%。Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.507，Shannon信息指數(shù)為1.046，表觀雜合度介于0.042～0.819之間，預(yù)期雜合度介于0.041～0.882之間，表明江西地區(qū)的毛花獼猴桃群體在分子水平具有豐富的多態(tài)性。除5號與61號引物外，其他引物表觀雜合度均小于預(yù)期雜合度，表明在野生毛花獼猴桃雄性群體中存在雜合子不足的現(xiàn)象。

表2 15對引物基本信息Table 2 Information of 15 pairs of primers

表3 15個SSR位點的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 15 primers used for SSR amplification and genetic parameters for each loci

5個毛花獼猴桃群體中多態(tài)性位點百分率最高的為廬山群體(100%)，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(0.500)也最高，15對引物共檢測到55個位點，所有位點均具多態(tài)性(100%)；南源山群體中檢測到的位點數(shù)最多，為62個位點，多態(tài)性位點百分率達到93.3%；麻姑山群體的多態(tài)性位點百分率最低，為80.0%，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)也最低(0.324)。群體平均多態(tài)性百分率達89.3%，群體的Nei′s遺傳多樣性指數(shù)的范圍介于0.324～0.500，平均為0.421，Shannon信息指數(shù)介于0.649～0.954，平均為0.811(表4)。

表4 野生毛花獼猴桃群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of wild Actinidiaeriantha Benth populations

2.2 群體遺傳分化和遺傳距離分析

由表5可知，5個毛花獼猴桃群體Nei′s遺傳距離范圍介于0.102～0.409之間，均值為0.253；遺傳一致度范圍為0.665～0.903，其均值為0.731。其中，武功山群體和井岡山群體之間的遺傳距離最小，麻姑山群體和武功山群體的遺傳距離最大。為分析距離對不同群體遺傳的影響，對各群體間的地理距離(表6)和遺傳距離進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，群體間的遺傳距離與地理距離之間無顯著相關(guān)性(r=0.334，P=0.345>0.05)

表5 毛花獼猴桃群體間的Nei′s遺傳距離和遺傳一致度Table 5 Genetic distance and genetic identity different populations

注：上三角：Nei′s遺傳一致度；下三角：遺傳距離。

Note:Above diagonal: Genetic identity. Below diagonal: Genetic distance.

表6 毛花獼猴桃雄株群體間地理距離Table 6 Geographic distance between male Actinidia eriantha populations

2.3 聚類分析

利用Nei′s遺傳距離對5個群體進行UPMGA聚類分析。由圖2可知，井岡山群體與武功山群體的遺傳距離最近，聚為一類，麻姑山與南源山群體聚在一起，廬山群體與其他群體的遺傳距離較大，單獨聚為一類。

圖2 5個毛花獼猴桃雄株不同群體的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of different groups of five male Actinidia eriantha populations

3 討論

本研究中毛花獼猴桃雄株的遺傳參數(shù)(Ne=3.002、Ⅰ=1.046)表明，野生毛花獼猴桃具有豐富的遺傳多樣性，這與湯佳樂等[30]的研究結(jié)果一致。此外，毛花獼猴桃雄株群體大部分位點表現(xiàn)出一定程度的多態(tài)性，各群體多態(tài)性位點百分率介于80%～100%之間。毛花獼猴桃群體的遺傳參數(shù)(Ne=2.3485、Ⅰ=0.8107、Nei′s=0.4205)表明群體水平上的遺傳多樣性較高，與楊妙賢等[16]的結(jié)果一致。5個毛花獼猴桃群體中遺傳多樣性最高的為廬山群體(Nei′s=0.500)，最低的為麻姑山群體(Nei′s=0.324)，進一步分析表明，廬山群體采自自然保護區(qū)，人為干擾少，從而保留了較高的遺傳多樣性，其他樣本均來自于路旁，人為干擾較大。麻姑山地區(qū)樣本量雖然較大，但毛花獼猴桃雄株在山北面潮濕地區(qū)分布較為集中，親緣關(guān)系較近，這可能是麻姑山群體Nei′s遺傳多樣性水平低于其他群體的原因。江西獼猴桃野生資源豐富，在野生條件下毛花獼猴桃與中華獼猴桃、京梨獼猴桃等不同種獼猴桃群居一起[31]，異花授粉增加了基因重組和變異的概率[32]，因此遺傳多樣性較高。此外，種子繁殖是一種重要的繁殖方式，毛花獼猴桃果實成熟后被動物取食，分散，從而提高了居群的遺傳多樣性[33]。

研究認為，孤立的居群中有親緣關(guān)系的個體發(fā)生雜交，可能會出現(xiàn)明顯的雜合子缺失現(xiàn)象[33]。本研究中，大多數(shù)位點的表觀雜合度小于預(yù)期雜合度，出現(xiàn)輕微的雜合子缺失現(xiàn)象，在很多種群中也有相似的情況[33-34]。一般認為，遺傳分化系數(shù)Fst值大于0.15，群體間的遺傳分化較大[35]。本研究中毛花獼猴桃遺傳分化系數(shù)的平均值為0.201，同時群體遺傳多樣性水平均低于總體水平，表明群體間基因交流有限，在毛花獼猴桃群體間存在較大的遺傳分化，這與劉亞令等[36]的研究結(jié)果一致。自然條件下毛花獼猴桃花粉主要通過風(fēng)媒傳播，花期在每年5-6月，此時江西地區(qū)雨水偏多，極大地影響了毛花獼猴桃花粉形式的基因交流。同時，群體間有山脈的阻擋，動物活動受限，導(dǎo)致群體間的基因交流較少，這可能是野生毛花獼猴桃群體間的地理距離和遺傳距離間無相關(guān)性的主要原因[33]。

4 結(jié)論

本研究對江西地區(qū)野生毛花獼猴桃遺傳多樣性進行分析，表明毛花獼猴桃雄株在物種水平和群體水平遺傳多樣性較高，5個毛花獼猴桃雄性群體的遺傳多樣性豐富度依次為廬山>井岡山>南源山>武功山>麻姑山。本試驗結(jié)果為闡明毛花獼猴桃的種質(zhì)遺傳多樣性，毛花獼猴桃種質(zhì)的保存及利用提供了一定的理論依據(jù)。在本研究種質(zhì)收集和保存的基礎(chǔ)上，開發(fā)出大量的SSR分子標(biāo)記，再利用生物信息學(xué)方法，能迅速尋找到大量的遺傳差異，結(jié)合獼猴桃雄株的重要性狀，如花粉量、花期、花色等，可以挖掘出影響獼猴桃性狀的基因，更好地開發(fā)和利用獼猴桃雄性資源。