胡雯雯, 陶建偉, 王慶偉, 李 靜, 閻 超, 許 旭*

(1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 上海 201418; 2. 上海通微分析技術(shù)有限公司, 上海 201203; 3. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200240)

復(fù)合維生素B片主要用于預(yù)防和治療B族維生素缺乏所致的營養(yǎng)不良、厭食、腳氣病、糖尿病等。按照衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS1-73(B)-89[1],每片復(fù)合維生素B片含5種B族維生素的量為:維生素B13 mg,維生素B21.5 mg,煙酰胺10 mg,維生素B60.2 mg,右旋泛酸鈣1 mg。按照標(biāo)準(zhǔn)分別采用重量法測(cè)定維生素B1的含量,紫外分光光度法測(cè)定維生素B2的含量,滴定法測(cè)定煙酰胺的含量。該操作繁瑣,且沒有維生素B6和泛酸鈣的含量測(cè)定方法。

文獻(xiàn)報(bào)道中復(fù)合維生素B片的含量測(cè)定多采用HPLC法、毛細(xì)管電泳法、LC-MS聯(lián)用法以及定量核磁共振波譜法。采用HPLC法[2-8]測(cè)定復(fù)合維生素B片中維生素成分的含量時(shí),其中泛酸鈣的含量測(cè)定方法較少提及,僅徐碩等[9]報(bào)道了HPLC同時(shí)測(cè)定一種進(jìn)口復(fù)合維生素B片中這5種維生素含量的方法。本實(shí)驗(yàn)室[10]建立了用定量核磁共振波譜測(cè)定復(fù)合維生素B片中除維生素B6的4種成分含量的方法。Eiff等[11]用定量核磁共振法分析水溶性和脂溶性維生素,但未對(duì)維生素B2進(jìn)行定量分析。也有采用LC-MS法對(duì)B族水溶性維生素進(jìn)行分析的報(bào)道[12,13]。毛細(xì)管電泳法測(cè)定的復(fù)合維生素B片中的成分主要是維生素B1、煙酰胺、維生素B2和維生素B6,也均未涉及泛酸鈣含量的測(cè)定,且通常測(cè)定精密度不高。Huopalahti等[14]采用區(qū)帶電泳法測(cè)定各組分峰面積的RSDs為2.1%～6.3%。Boonkerd等[15]針對(duì)精密度問題還使用了內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行校正計(jì)算。另外一些使用普通毛細(xì)管電泳儀測(cè)定復(fù)合維生素B片的文獻(xiàn)報(bào)道中精密度(RSD)分別為3.5%～4.8%[16]和1.8%～4.7%[17]。

高精度定量毛細(xì)管電泳儀通過引入具有精確內(nèi)部定量環(huán)的nL級(jí)進(jìn)樣閥,改善了進(jìn)樣體積精度,配合相應(yīng)的自動(dòng)進(jìn)樣控制系統(tǒng)和毛細(xì)管溫控系統(tǒng),有助于提高毛細(xì)管電泳的定量重復(fù)性和準(zhǔn)確度[18,19]。本研究使用高精度定量毛細(xì)管電泳儀,建立了高精度同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B片中5種維生素含量的方法,獲得了較好的定量精密度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高精度定量毛細(xì)管電泳儀包括自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、高壓電源、微流注射泵、四通進(jìn)樣閥及qSepTM-3010色譜工作站(上海通微分析技術(shù)有限公司)。精密天平(M2P型,精度為0.001 mg,德國Sartorius公司)。帶有電隔離槽的石英毛細(xì)管(進(jìn)樣端帶隔離槽,內(nèi)徑75 μm,總長(zhǎng)度65 cm,有效長(zhǎng)度45 cm,上海通微分析技術(shù)有限公司)。

維生素B1(鹽酸硫胺素,含量98%)、維生素B2(核黃素,含量98%)、煙酰胺(含量99%)均購自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司;泛酸鈣對(duì)照品(含量97.5%)購自中國藥品生物制品檢定院;維生素B6(鹽酸吡多辛,HPLC級(jí),含量98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十水合四硼酸鈉和硼酸均為分析純,購自上海國藥試劑有限公司;乙腈(HPLC級(jí))購自上海泰坦科技有限公司;蒸餾水購自屈臣氏;復(fù)合維生素B片藥品均購自上海零售藥房。

1.2 樣品預(yù)處理

取10片復(fù)合維生素B片,計(jì)算平均片重,置研缽中研成細(xì)粉,從中取0.43 g樣品置于10 mL離心管中,加9 mL乙腈-水(20∶80, v/v),渦旋振蕩2 min,在60 ℃超聲提取至溶液中粉末為白色,在3 000 r/min條件下離心3 min后取上清液,過0.22 μm水相濾膜,得到復(fù)合維生素B片提取溶液。

5種維生素均用乙腈-水(20∶80, v/v)配制混合儲(chǔ)備溶液,其維生素B1、B2、B6、煙酰胺和泛酸鈣的質(zhì)量濃度分別為5.04、1.07、2.71、16.46和5.19 g/L?；旌蟽?chǔ)備溶液分別用乙腈-水(20∶80, v/v)稀釋1、2、5、10、25和50倍,配制成混合維生素樣品溶液。

1.3 毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)

新毛細(xì)管按其使用說明用超純水沖洗30 min,每次實(shí)驗(yàn)前用pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液沖洗毛細(xì)管柱30 min,兩次進(jìn)樣間隔使用沖洗程序清洗進(jìn)樣針頭和進(jìn)樣管路,實(shí)驗(yàn)當(dāng)天完成樣品分析后用流速為0.8 μL/min的乙腈-水(10∶90, v/v)沖洗毛細(xì)管柱至少1 h。

分離緩沖液為40 mmol/L pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液。分離過程中注射泵以1.0 μL/min的流速持續(xù)通入分離緩沖液,該分離緩沖液分流后通過分離毛細(xì)管。進(jìn)樣電壓為-10 kV。進(jìn)樣量為10 nL(定量閥自動(dòng)進(jìn)樣)。沒有使用毛細(xì)管柱溫控制系統(tǒng)。檢測(cè)波長(zhǎng)在10 min內(nèi)為280 nm,用于檢測(cè)維生素B1、B2、B6和煙酰胺,10 min以后轉(zhuǎn)換為210 nm,用于檢測(cè)泛酸鈣。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管電泳分離結(jié)果

使用選定的毛細(xì)管電泳條件,混合維生素樣品溶液和復(fù)合維生素B片提取溶液中各成分可在15 min內(nèi)完全分離,結(jié)果見圖1。

圖 1 (a)5種維生素混合溶液和(b)復(fù)合維生素B片提取溶液的電泳圖Fig. 1 Electrophoregrams of (a) the mixture of five vitamins and (b) multivitamin B tablet extract solution Peak Nos: 1. vitamin B1(thiamin); 2. nicotinamide; 3. vitamin B2(riboflavin); 4. vitamin B6(pyridoxine); 5. pantothenate.

2.2 樣品提取溶劑的選擇

維生素B1、B6、煙酰胺和泛酸鈣的水溶性較好。維生素B2微溶于水,盡管在堿性溶液中容易溶解,但維生素B1和B6在堿液中易被破壞?？赏ㄟ^添加乙腈[15]提高維生素B2的溶解性,并可保證其他4種維生素均可溶解。試驗(yàn)比較了不同比例乙腈的提取效果,使用10%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈提取時(shí),維生素B2的測(cè)定結(jié)果偏低;而使用高于20%的乙腈提取時(shí),含量測(cè)定結(jié)果基本不變。考慮到純乙腈可能影響后面的毛細(xì)管電泳分離,故提取溶劑選擇為乙腈-水(20∶80, v/v)。樣品預(yù)處理方法見1.2節(jié)。

2.3 緩沖液濃度的影響

緩沖液濃度是影響分析物遷移行為的重要因素。隨著硼砂緩沖液濃度的增加,5種分析物的遷移時(shí)間不斷增大(見圖2a),其分離度(見圖2b)和峰形也越來越好,并在40 mmol/L時(shí)獲得了最好的分離效果。繼續(xù)增大緩沖液濃度至50 mmol/L,電流較大,較高的電流會(huì)產(chǎn)生大量的焦耳熱,導(dǎo)致基線不平、分離效率下降。故最終確定硼砂緩沖液的濃度為40 mmol/L。

圖 2 緩沖液濃度對(duì)(a)遷移時(shí)間和(b)分離度的影響Fig. 2 Effects of buffer concentrations on (a) migrationtime and (b) resolutionThe subscripted number after R is the peak number of the two adjacent peaks in Fig. 1.

2.4 緩沖液pH的影響

緩沖液pH是影響分離及電滲的關(guān)鍵因素。考察了緩沖液不同pH值對(duì)分離的影響,結(jié)果見圖3。在pH 9.0時(shí)5種成分可在較短的遷移時(shí)間實(shí)現(xiàn)完全分離。當(dāng)pH繼續(xù)增大,電流上升,焦耳熱增大引起區(qū)帶展寬,導(dǎo)致最后兩個(gè)峰(維生素B2和泛酸鈣)的分離度變差。

2.5 分離電壓的影響

電壓越高,分離時(shí)間越短,但在高壓下焦耳熱會(huì)增大引起峰展寬。比較了電壓為-5、-8、-10、-15 kV(相應(yīng)的電流在13到48 μA)的效果,結(jié)果在較低電壓(-5和-8 kV)時(shí),分離時(shí)間較長(zhǎng),維生素B2和B6不能完全分開。在-10 kV電壓下,5種成分完全分離。

2.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)[2,5,9,20]報(bào)道維生素B1、B2、B6和煙酰胺可在266、270、275、280 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè),試驗(yàn)比較了266～280 nm處的檢測(cè)效果。結(jié)果顯示,波長(zhǎng)增大,煙酰胺峰高減小,維生素B6峰高增大。實(shí)際樣品中因煙酰胺含量高,而維生素B6含量低,故選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。泛酸鈣僅在低波長(zhǎng)處有末端吸收,故選擇210 nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。由于9.5 min時(shí),前面4種物質(zhì)已完成分離,而泛酸鈣在10.5 min以后才開始出峰,因此使用波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的程序設(shè)置,前10 min的檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm,在10 min時(shí)轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)為210 nm以檢測(cè)泛酸鈣。

2.7 添加劑的影響

為了控制電滲、改善分離選擇性以及減少毛細(xì)管內(nèi)壁吸附,考察了在緩沖液中加入羥丙基-β-環(huán)糊精、乙腈、甜菜堿和EDTA的分離效果。結(jié)果顯示,緩沖液中加入這些添加劑對(duì)組分的遷移和分離并無明顯改善。故沒有使用添加劑。

2.8 毛細(xì)管柱溫的影響

比較了室溫(不控溫)和恒溫(20 ℃,使用毛細(xì)管柱溫控制系統(tǒng))對(duì)峰面積重復(fù)性的影響,結(jié)果恒溫對(duì)精密度有改進(jìn),但兩者精密度RSD的最大值相差不大,為操作方便,使用不控溫的室溫實(shí)驗(yàn)。

2.9 方法學(xué)驗(yàn)證

2.9.1線性關(guān)系和檢出限

精密取一定量的對(duì)照品混合液配制6個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果(見表1)表明,5種化合物在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)為0.996 8～0.999 8。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液逐漸稀釋,取信噪比(S/N)為3時(shí)組分的質(zhì)量濃度為檢出限(LOD)。

y: peak area;x: mass concentration, g/L.

2.9.2精密度

配制維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6和泛酸鈣的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,在一天8 h內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次,維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6和泛酸鈣的峰面積日內(nèi)RSD值分別為1.9%、1.4%、1.3%、1.7%和1.7%。文獻(xiàn)中采用電泳法測(cè)定不同維生素的RSDs分別為2.1%～6.3%[14]、7%～10%(非內(nèi)標(biāo)校正方法)[15]、3.5%～4.8%[16]和1.8%～4.7%[17],顯示本方法及儀器精密度優(yōu)于文獻(xiàn)方法。

配制維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6和泛酸鈣的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,連續(xù)測(cè)定6天,計(jì)算日間精密度的峰面積RSDs值(n=6)在3.1%～5.7%之間,低于上述日內(nèi)精密度,而且重復(fù)測(cè)定日內(nèi)和日間精密度仍然如此。推測(cè)原因可能是過夜后有樣品成分不穩(wěn)定[21]。因此已配制溶液要在一天內(nèi)完成測(cè)定。

2.9.3回收率

分兩批在已知含量的復(fù)合維生素B片中分別加入前3種組分(維生素B1、煙酰胺和維生素B2)和后2種組分(維生素B6和泛酸鈣)的對(duì)照品,分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)。測(cè)定并計(jì)算各組分的平均回收率和RSDs,結(jié)果見表2。復(fù)合維生素B片的加標(biāo)回收率為94.07%±5.30%～98.87%±3.99%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～5.6%。

表 2 5種組分加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.10 樣品分析

用建立的方法對(duì)3個(gè)批次復(fù)合維生素B片進(jìn)行含量測(cè)定,每個(gè)樣品測(cè)定2次,取平均值,根據(jù)取樣量計(jì)算其相當(dāng)于標(biāo)示量的百分比,結(jié)果見表3。

表 3 復(fù)合維生素B片樣品測(cè)定結(jié)果相當(dāng)于標(biāo)示量的百分比(n=2)

3 結(jié)論

本文使用全自動(dòng)定量毛細(xì)管電泳系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了復(fù)合維生素B片中維生素B1、B2、B6、煙酰胺和泛酸鈣的分離和高精度含量測(cè)定。該方法簡(jiǎn)便快速、精密度好、準(zhǔn)確可靠,可用于復(fù)合維生素B片中維生素B1、B2、B6、煙酰胺和泛酸鈣含量的同時(shí)測(cè)定。