徐陳鳳, 惠文凱, 孫莉莉, 高倩倩, 鄒巧根*

(1. 南京工業(yè)大學, 江蘇 南京 211800; 2. 正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司, 江蘇 連云港 222000; 3. 海納醫(yī)藥科技股份有限公司, 江蘇 南京 210009)

亞葉酸(leucovorin, LV)為四氫葉酸在體內的次生代謝產物(結構見圖1),是合成核酸的主要輔酶,也是四氫葉酸在體內的活性形式之一。亞葉酸能有效對抗甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)引起的毒性反應,作為大劑量甲氨蝶呤的解救劑[1,2],是最早使用的化學保護劑;亞葉酸也能提升氟嘧啶類化合物的細胞毒性,是多種癌癥如胃癌和結直腸癌[3]聯合化療藥物中廣泛使用的化療輔助藥物。亞葉酸一般以非對映異構體混合物的形式存在,臨床試驗證明,亞葉酸的生物活性物質為左旋體,稱為左亞葉酸(6S-LV),在體內會經肝臟迅速代謝為活性代謝產物6S-5-甲基四氫葉酸[4,5](6S-5-methyltetrahydrofolate, 6S-5-MeTHF),右亞葉酸(6R-LV)則基本無藥理活性[6]。

圖 1 亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的化學結構Fig. 1 Chemical structures of leucovorin (LV) and5-methyltetrahydrofolate (5-MeTHF)* The chiral center.

左亞葉酸的首次分離是在1952年實現的[7]?，F有測定亞葉酸及5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate, 5-MeTHF,結構見圖1)的分析方法多為液相色譜法[8-10]和LC-MS/MS法[11-13]。Schleyer等[10]開發(fā)的液相色譜法能同時拆分亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對非對映異構體,但其流動相采用磷酸鹽緩沖體系,不適用于液相色譜-質譜聯用系統(tǒng),同時該方法靈敏度低。Liu等[11]開發(fā)的LC-MS/MS法,在僅達到基本基線分離的情況下,需使用兩個方法才能將亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對非對映異構體拆分;同時該方法前處理步驟繁瑣、耗時長,不適用于大批量生物樣本檢測。早期文獻[12]則采用復雜的柱切換技術,方法耗時且靈敏度低。

手性是生物系統(tǒng)的基本特征之一,目前臨床上所用藥物中約40%是手性藥物[14],除天然產物外,約75%的合成手性藥物則是以外消旋體的形式存在[15]。藥物對映體立體化學的不同使其與各受體的親和力不同,導致藥理作用的差異極大,如張怡穎等[16]拆分了存在一個不對稱手性中心的甲基苯丙胺(methamphetamine, METH),其S-(+)-METH和R-(-)-METH對中樞神經作用和毒性機制均有很大不同。由此可見,在進行臨床藥物代謝動力學與血藥濃度檢測時有必要從對映體的藥效學角度來選擇測定的目標化合物。

本研究建立了基于超濾離心前處理且能夠同時定量拆分人血漿中亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對非對映異構體的LC-MS/MS法。該方法快速、簡便、靈敏度高,已成功應用于人體藥物代謝動力學研究,同時能為后期進行左亞葉酸制劑生物等效性研究提供技術支持。

表 1 工作溶液的質量濃度

STD: standard sample; LLOQ: lower limit of quantification; LQC: low quantification; MQC: middle quantification; HQC: high quantification.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1100液相色譜儀(美國Agilent Technologies公司)串聯API 4000 Q Trap質譜(加拿大AB Sciex公司),配備數據采集軟件Analyst 1.6.3。

亞葉酸對照品(鈣鹽,純度85.6%,批號100252-101204)和甲氨蝶呤對照品(純度99.8%,批號100138-201606)均購自中國食品藥品檢定研究院;5-甲基四氫葉酸對照品(鈣鹽,純度99.0%,批號F0M040,美國USP Certificate);甲醇、三氟乙酸銨、乙酸、巰基乙醇、乙酸銨和抗壞血酸(均為色譜級,阿拉丁公司)。受試制劑(T1):注射用左亞葉酸鈉(50 mg,批號160421201-1,南京海納醫(yī)藥科技股份有限公司);參比制劑(R1):注射用亞葉酸鈉(100 mg,批號21415002-3,武漢人福藥業(yè)有限責任公司)。

1.2 標準溶液與標準加樣血漿的配制

精密稱取適量亞葉酸、5-甲基四氫葉酸、甲氨蝶呤對照品,經質量校正系數校正后,將其溶于50%(體積分數,下同)甲醇-水(含500 mg/L巰基乙醇和抗壞血酸)中,得到最終質量濃度分別為200、200、100 mg/L的儲備液,分裝后置于-80 ℃冰箱保存。以50%甲醇-水(含500 mg/L巰基乙醇和抗壞血酸)為溶劑稀釋亞葉酸和5-甲基四氫葉酸儲備液,獲得8個水平的標準曲線樣品系列工作溶液(STD1～STD8)和5個水平的質控樣品系列工作溶液(定量下限質控樣品簡寫為LLOQ,低濃度質控樣品簡寫為LQC,中濃度質控樣品簡寫為MQC,高濃度質控樣品簡寫為HQC,定量上限質控樣品簡寫為ULOQ),工作溶液具體質量濃度見表1。所有工作液均置于-20 ℃冰箱保存。取20 μL相應工作溶液加入380 μL空白血漿,配制成相應標準加樣血漿。

1.3 樣品前處理

精密移取200 μL血漿,加入50 μL內標工作液(含500 μg/L甲氨蝶呤)、500 μL甲醇,渦旋3 min,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心10 min,取450 μL上清至孔徑為3 kDa的0.5 mL超濾離心管中,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心20 min,收集濾液待分析。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜柱:手性HSA柱(150 mm×4 mm, 5 μm,英國Chrom Tech Inc);柱溫:25 ℃;自動進樣器溫度:4 ℃;流動相A: 10 mmol/L乙酸銨(用冰醋酸調節(jié)pH至8.0);流動相B:乙腈;進樣量:20 μL。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 100%A; 0.5～2.5 min, 100%A～85%A; 2.5～10.0 min, 85%A; 10.0～12.0 min, 85%A～100%A; 12.0～14.0 min, 100%A。

正離子電噴霧離子(ESI)源;多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子化電壓為5 000 V;離子源溫度為600 ℃;氣簾氣(CUR)流速為25 L/h;錐孔氣(GS1)流速為45 L/min;去溶劑氣(GS2)流速為40 L/min。去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞池出口電壓(CXP)及其他條件見表2。

1.5 臨床試驗方案

本試驗經皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批,合理可行。篩選6位健康志愿受試者,試驗前簽署知情同意書。

研究采用單中心、兩制劑、兩周期、交叉試驗設計。每周期試驗的第1天早晨,所有受試者在復查生命體征后,埋置靜脈留置導管,并于給藥前0.5和0 h采集空白血樣。受試者在2 h內分別靜脈滴注125 mg/m26R,S-LV或62.5 mg/m26S-LV,于給藥后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0(給藥結束)、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、12、24、36、48 h由前臂靜脈采血4 mL,記錄實際采血時間。所采集的血樣置于5 mL一次性負壓枸櫞酸鈉抗凝采血管中,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心10 min,分離出的血漿樣本中加入含有50 mg/L的抗壞血酸和50 mg/L巰基乙醇甲醇溶液,置于已標記好的Axygen試管中,于-80 ℃的低溫冰箱中保存待測。

表 2 質譜參數的優(yōu)化

DP: declustering potential; EP: entrance potential; CE: collision energy; CXP: collision cell exit potential; IS: internal standard.

2 結果與討論

2.1 血漿樣品前處理優(yōu)化

在生物樣品分析研究中樣品前處理步驟關系到測定靈敏度和研究結果的可靠性。本研究采用簡便快速的蛋白質沉淀和液液萃取法進行樣品前處理。但發(fā)現蛋白質沉淀存在嚴重的基質效應,而液液萃取則提取回收率低,無法滿足試驗所需靈敏度。因此,傳統(tǒng)的前處理方法并不能達到令人滿意的結果。Liu等[11]報道了一種蛋白質沉淀-固相萃取預處理方法,該方法無基質效應,且提取回收率較高,但該方法前處理步驟繁瑣且耗時長,需花費近5 h來完成整個前處理過程,檢測效率較低,不適用于大批量血漿樣本的檢測。

超濾技術是介于微濾和納濾之間的一種膜分離技術,平均孔徑為3～100 nm,具有凈化、分離、濃縮溶液等功能,其截留機理主要包括膜的篩分作用和靜電作用,常應用于蛋白質濃縮[17]和測定血漿蛋白質結合率。近年來,超濾離心結合蛋白質沉淀[18]和添加解離劑[19]已成功應用于樣品前處理和臨床研究中的在線監(jiān)測。在本研究中由于6R-LV和6S-LV的血漿蛋白質結合率不同,因此難以確定既滿足使結合藥物完全釋放又無蛋白質沉淀現象出現的解離劑體積。故最終選用超濾離心結合蛋白質沉淀作為樣品前處理方法。

超濾離心濾膜的孔徑大小和離心時間可影響亞葉酸和5-甲基四氫葉酸非對映異構體的提取回收率。本研究在保持其他參數恒定的情況下測試了3種不同孔徑(3、10和50 kDa)超濾離心管的提取情況。結果顯示3 kDa孔徑超濾離心管最適宜。因為10和50 kDa孔徑超濾離心管具有嚴重的基質效應;而3 kDa孔徑超濾離心管非特異性吸附效應更強,但其靈敏度仍滿足要求。

離心時間經過考察確定為20 min,更長的離心時間并不會增加待測物的回收率。

2.2 方法學驗證

方法學驗證內容與接受標準參考美國食品藥品監(jiān)督管理局[20]最新指導原則。

2.2.1專屬性

為消除空白血漿中內源性亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的干擾,將空白血漿按如下方法[10]處理:向空白血漿中加入適量甲酸,使內源性葉酸降解,然后用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.4。

取6批不同來源的空白血漿,按1.3節(jié)方法(其中內標工作液用含500 mg/L巰基乙醇和抗壞血酸的50%甲醇-水代替)處理后進樣。取空白血漿配制定量下限(LLOQ)質量濃度(含25 μg/L 6R-LV、25 μg/L 6S-LV、12.5 μg/L 6R-5-MeTHF、12.5 μg/L 6S-5-MeTHF)的血漿樣品及健康受試者靜脈注射125 mg/m26R,S-LV、62.5 mg/m26S-LV 2.5 h后的血漿樣品,按1.3節(jié)方法處理后進樣,色譜圖見圖2。結果顯示,亞葉酸非對映異構體和5-甲基四氫葉酸非對映異構體均完全分離,血漿內源性物質不干擾測定,同時待測物與內標的測定互不干擾。

2.2.2線性試驗

按1.2節(jié)方法配制相應濃度的標準曲線樣品工作溶液,取20 μL工作溶液,加入380 μL空白血漿,稀釋成標準曲線樣品,按1.3節(jié)方法處理進樣。以待測物與內標的峰面積比值Y為縱坐標、待測物血樣質量濃度X(單位μg/L)為橫坐標進行線性回歸,得到待測物6R-LV、6S-LV、6R-5-MeTHF和6S-5-MeTHF的回歸方程分別為Y=3.53×10-4X+1.01×10-3、Y=3.7×10-4X+1.47×10-3、Y=1.78×10-3X+2.51×10-3和Y=1.71×10-3X+1.09×10-3;相關系數r分別為0.999 0、0.999 1、0.998 9和0.998 2。結果顯示各待測物線性關系良好。

2.2.3準確度、精密度與穩(wěn)定性

按1.2節(jié)方法,配制相應濃度的質控樣品工作溶液。取75 μL相應工作溶液,加入1 425 μL空白血漿,稀釋成質控樣品。按1.3節(jié)方法處理后進樣。每個濃度有6份重復質控樣品。連續(xù)測定3批,至少分兩天完成。準確度精密度結果見表3。

表 3 亞葉酸和5-甲基四氫葉酸在不同加標水平下的準確度和精密度(n=6)

表 4亞葉酸和5-甲基四氫葉酸在不同加標水平下的基質效應和回收率(n=6)

Table 3Matrix effects and recoveries of LV and 5-MeTHFunder different spiked levels (n=6)

同上制備低、高濃度質控樣品(LQC、HQC)若干份,其中6份按1.3節(jié)方法處理后立即進樣,然后將該樣品置于4 ℃進樣器,放置52 h后再進樣測定。另取6份反復凍融3次,6份避光于室溫放置4 h, 6份于-80 ℃下保存30 d,然后將這18份血漿樣品按1.3節(jié)方法處理后進樣測定,將樣品的測得濃度與理論濃度相比較;同時考察儲備液于-80 ℃下保存30 d、工作液于室溫放置4 h和-20 ℃下保存3 d的檢測結果,結果表明其偏差均在±15%范圍內?？梢?在以上條件下亞葉酸與5-甲基四氫葉酸的穩(wěn)定性均良好。

2.2.4提取回收率與基質效應

按2.2.3節(jié)方法配制低、中、高濃度質控樣品(LQC、MQC、HQC),對基質效應和提取回收率進行考察。血漿中待測物的提取回收率和經內標歸一化的基質效應考察結果見表4。內標甲氨蝶呤提取回收率為(78.9±0.04)%。結果表明,在本試驗條件下,待測物的回收率均良好,血漿基質效應對測定無影響。

2.2.5稀釋準確性驗證

按1.2節(jié)方法配制含400 mg/L 6R-LV、400 mg/L 6S-LV、240 mg/L 6R-5-MeTHF和240 mg/L 6S-5-MeTHF的工作溶液,取20 μL該工作溶液,加入380 μL空白血漿,配制成含20 mg/L 6R-LV、20 mg/L 6S-LV、6 mg/L 6R-5-MeTHF、6 mg/L 6S-5-MeTHF的稀釋質控樣品(DQC)。取50 μL DQC,加入150 μL空白血漿,得到進一步稀釋后的DQC,平行制備6份,按1.3節(jié)方法處理后進樣。結果顯示,所有經稀釋后的DQC檢測結果的平均值相對于理論值的偏差在±15.0%以內,所有DQC檢測結果標準偏差為5.63%,表明該方法稀釋準確性良好。

2.3 藥代動力學研究

采用本方法測定6名健康受試者靜脈滴注125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后的血藥濃度,以時間(單位為h)為橫坐標、測定的血藥質量濃度(單位為μg/L)為縱坐標繪制標準曲線,活性成分6S-LV和6S-5-MeTHF的平均血藥濃度-時間曲線見圖3; DAS 3.2.8軟件計算的藥代動力學參數見表5。

圖 3 受試者靜脈注射62.5 mg/m26S-LV和125 mg/m26R,S-LV后活性成分6S-LV和6S-5-MeTHF平均血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig. 3 Mean drug mass concentration-time profiles of 6S-LV and 6S-5-MeTHF in human plasma afterintravenous administration of 62.5 mg/m26S-LV and 125 mg/m26R,S-LV (n=6)

表 5 主要藥代動力學參數(n=6)

Cmax: maximum observed concentration; AUC0-t: area under the curve from the time of dosing (dosing-time) to the last measurable concentration;Tmax: time of Cmax;t1/2: terminal half-life; CL: apparent total body clearance;V: apparent volume of distribution.

表 6 6S-LV和6S-5-MeTHF藥代動力學參數等效性評價(n=6)

AUC0-∞: area under the curve from dosing time extrapolated to infinity, based on the last predicted concentration;T1/R1: the relevant parameter of 62.5 mg/m26S-leucovorin dosage divided by 125 mg/m26R,S-leucovorin; CV: coefficient of variation.

結果顯示,受試者給予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后,均未在體內檢測到6R-5-MeTHF,表明6R-5-MeTHF不會在體內生成;同時,受試者給予62.5 mg/m26S-LV后,未在體內檢測到6R-LV,表明體內未發(fā)生藥物手性轉置。以相同劑量6S-LV計,受試者給予單一左旋體或外消旋體后,對體內有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF主要藥代動力學參數(血漿峰濃度Cmax、從時間點0到最后可定量時間點的藥物代謝動力學時間曲線下面積AUC0-t、從時間點0到無限的藥物代謝動力學時間曲線下面積AUC0-∞)劑量校正后再進行自然對數轉換,然后對其進行方差分析,并進一步采用雙向單側T檢驗和(1-2α)%(檢驗水準,α=0.05)置信區(qū)間法進行受試者給予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后體內活性成分藥代動力學參數的等效性評價,具體結果見表6。同時對體內有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF的達峰時間(Tmax)采用非參數(Wilcoxon符號秩檢驗)檢驗法進行檢驗,P>0.05。以上結果證明,受試者給予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后,體內有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF的主要藥物代謝動力學參數均無顯著差異,藥物代謝動力學特征一致,吸收的速度和程度一致。

3 結論

本文建立了基于超濾離心前處理且能夠同時定量拆分人血漿中亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對非對映異構體的HPLC-MS/MS法。相較于之前的研究,該方法在消除基質效應的前提下,比固相萃取前處理操作簡單且耗時短,極大地提高了生物樣品檢測的效率,同時還具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點。已成功應用于人體藥代動力學研究,并能夠為后期進行左亞葉酸制劑人體生物等效性研究提供技術支持。

本文成功將超濾離心技術運用于生物樣品前處理,揭示了其在生物樣品前處理運用中的前景。超濾離心應用于生物樣品前處理仍存在一些需要改進和繼續(xù)研究的內容,而其中非特異性吸附導致的回收率低則是首要難關,因為這將限制超濾離心在高靈敏度檢測中的應用,這些現存問題將在后續(xù)研究中深入討論。