牛春曉 高艷武 常婷 李柱一

重癥肌無力(MG)是由自身抗體介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病[1],CD4+輔助性T細(xì)胞亞群在MG發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2-3]。褪黑素是一種主要由松果體在夜間分泌的激素,除同步睡眠之外,還可執(zhí)行多種生理功能,包括抗氧化和免疫調(diào)節(jié)[4]。研究表明褪黑素可通過對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)[5]多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)[6]、多發(fā)性硬化[5]中發(fā)揮保護(hù)性作用。目前者對(duì)褪黑素是否在MG中也發(fā)揮保護(hù)性作用的研究尚未見報(bào)道。本研究通過觀察MG患者血清褪黑素水平及褪黑素受體系統(tǒng)表達(dá)的變化,并分析其與MG病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性,旨在初步探討褪黑素在MG中的可能作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象(1)MG組:隨機(jī)收集2017年12月至2018年08月作者醫(yī)院收治的MG患者15例,均符合MG診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男5例、女10例,年齡14～85歲,平均(40.3±17.6)歲;病程1～17年,中位數(shù)3年,四分位數(shù)間距5年。15例MG患者中,合并胸腺瘤4例,其中2例接受胸腺瘤切除手術(shù)。3例為眼肌型,12例為全身型。服用免疫抑制劑者8例,未服用免疫抑制劑者7例。所有患者行肌無力相關(guān)抗體檢測(cè),其中抗乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AChR-Ab)陽性者14例,抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶(musclespecific receptor tyrosine kinase,MuSK)抗體陽性者1例。重復(fù)頻率電刺激檢測(cè),14例患者出現(xiàn)多支神經(jīng)低頻遞減,1例未見異常。15例患者中僅1例合并其他自身免疫性疾病(甲狀腺功能亢進(jìn))。(2)對(duì)照組:選取與MG組年齡和性別相匹配的健康人15名作為對(duì)照組,其中男6名、女9名,年齡23～63歲,平均(40.4±13.8)歲。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書,該研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要儀器和試劑10 m L肝素鈉抗凝管、抗人CD4-FITC抗體、破核膜液、FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司),人淋巴細(xì)胞分離液(美國GE公司),人褪黑素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(中國Elabscience公司),抗人RORɑ-PE抗體(美國R&D公司),RIPA裂解液(中國碧云天公司),兔抗人 MT1抗體、兔抗人RORɑ抗體、鼠抗人βactin抗體(英國abcam公司),山羊抗兔Ig G二抗、山羊抗鼠IgG二抗(中國Servicebio公司)。

1.3 方法均于上午9:00至10:00使用10 m L肝素鈉抗凝管收集外周血,4℃靜置2 h后低溫1500r/min離心10 min,吸取上層淡黃色清亮血清,分裝至EP管,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)分離及褪黑素受體檢測(cè):去除血清的血液,加入等體積磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)混勻后,沿管壁緩慢平鋪到相同體積的人淋巴細(xì)胞分離液上層,利用密度梯度離心原理,將各種血液成分按密度分離。離心后分為三層,上層為血漿;下層為紅細(xì)胞與粒細(xì)胞;中間白膜層為PBMCs。將收集的PBMCs用PBS洗滌后分為兩部分,一部分轉(zhuǎn)移到流式管中,用于檢測(cè)褪黑素核受體系統(tǒng)表達(dá),另一部分PBMCs用凍存液〔(90%Fetal Bovine Serum(FBS)+10%dimethyl sulfoxide(DMSO)〕重懸于凍存管中,-80℃保存,用于檢測(cè)褪黑素膜受體MT1及核受體RORɑ表達(dá)。

1.3.2 血清褪黑素水平檢測(cè):取血清,按照人褪黑素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)血清褪黑素水平。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)褪黑素核受體系統(tǒng)表達(dá):將流式管中收集的PBMCs以1500r/min離心10 min后去上清,加入抗人CD4-FITC抗體5μL,4℃避光30 min,PBS洗滌后加入破核膜液1 m L,4℃避光45 min,用洗滌液2 m L洗滌2次,去上清,加入抗人RORɑ-PE抗體5μL,4℃避光40 min,洗滌2遍后用300μL PBS懸浮,上機(jī)檢測(cè)。使用Flowjo 7.6.1軟件分析流式檢測(cè)結(jié)果,根據(jù)前向散射光(forward scatter,FSC)和側(cè)向散射光(side scatter,SSC)圈出淋巴細(xì)胞,以SSC為縱坐標(biāo),CD4-FITC為橫坐標(biāo)圈門,即可得到淋巴細(xì)胞中CD4+輔助T細(xì)胞比例;以RORɑ-PE為縱坐標(biāo),CD4-FITC為橫坐標(biāo)圈門,第四象限表示CD4+RORɑ+細(xì)胞比例;由于CD4+RORɑ+細(xì)胞比例較低,選中第四象限,將縱坐標(biāo)設(shè)為Histogram,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到RORɑ+CD4+T細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI),同理可以得到第三象限 RORɑ-CD4+T 細(xì)胞 MFI,計(jì)算 RORɑ+CD4+T細(xì)胞與RORɑ-CD4+T細(xì)胞MFI比值(簡(jiǎn)稱MFI比值)。

表1 MG患者和健康對(duì)照褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達(dá)(n=15,±s)

表1 MG患者和健康對(duì)照褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達(dá)(n=15,±s)

注:MG:重癥肌無力,表2同;PBMCs:外周血單個(gè)核細(xì)胞;MFI:平均熒光強(qiáng)度

組別 血清褪黑素水平(pg/m L)淋巴細(xì)胞中CD4+輔助T細(xì)胞比例(%)CD4+輔助T細(xì)胞RORɑ+細(xì)胞比例(%) MFI比值 MT1相對(duì)表達(dá) RORɑ相對(duì)表達(dá)MG組 381.2±79.34 33.66±11.72 0.68±0.45 1.11±0.18 0.35±0.16 0.57±0.23對(duì)照組 403.8±43.07 39.28±14.47 0.92±0.57 1.04±0.08 0.55±0.21 0.45±0.15 t值 0.34 0.93 1.25 0.33 2.49 1.38 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＞0.05

1.3.4 WB檢測(cè)褪黑素膜受體MT1及核受體RORɑ表達(dá):將-80℃保存的PBMCs復(fù)蘇,用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解,取蛋白溶液,按照說明書用BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將10μg蛋白放入電泳孔中用12%分離膠電泳。將分離蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上,用兔抗人MT1抗體(1∶1000)或兔抗人RORɑ抗體(1∶1000)或鼠抗人β-actin抗體(1∶100),4℃孵育過夜。使用辣根過氧化物酶連接的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二抗(1∶3000),室溫下孵育30 min。在暗室中將WB增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑ECLA(enhanced chemiluminescence A)和ECLB等體積混合,將PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣兩層薄膜之間,加入混合好的ECL溶液充分反應(yīng),曝光。用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。WB結(jié)果由PhotoShop整理去色,用ImageJ軟件將圖片轉(zhuǎn)化為灰度圖片,消除背景影響后設(shè)置面積、平均密度、灰度值及綜合密度為定量參數(shù),將圖片轉(zhuǎn)換成亮帶,對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析:圈起每個(gè)條帶得到其綜合灰度值,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參(MT1/βactin,RORɑ/β-actin)綜合灰度的比值(即目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量)。

1.3.5 相關(guān)性分析:根據(jù)定量MG評(píng)分系統(tǒng)(quantitative MG scoring system,QMGs)對(duì)患者基本嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估。將MG患者血清褪黑素水平、MG患者膜受體MT1與核受體RORɑ表達(dá)與QMGs評(píng)分進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,兩均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn);用SPSS 20.0進(jìn)行相關(guān)性分析,MG患者QMGs評(píng)分與褪黑素水平以及受體表達(dá)相關(guān)性采用Spearman檢驗(yàn)分析;多組均數(shù)間比較采用方差分析,兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達(dá)MG患者血清褪黑素水平與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中使用免疫抑制劑〔(387.7±76.45)pg/m L〕、未使用免疫抑制劑〔(373.7±88.02)pg/m L〕的MG患者與健康對(duì)照組〔(403.8±43.07)pg/m L〕三組間比較血清褪黑素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.544,P＞0.05),三組間兩兩比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示:MG患者和健康對(duì)照組淋巴細(xì)胞中CD4+輔助T細(xì)胞比例、CD4+輔助T細(xì)胞中RORɑ表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),患者與健康對(duì)照組MFI比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WB結(jié)果顯示:MG患者PBMCs中褪黑素膜受體MT1表達(dá)明顯低于健康對(duì)照(P＜0.05),核受體RORɑ表達(dá)同健康對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。具體結(jié)果見表1。

2.2 相關(guān)性分析MG患者血清褪黑素水平、MG患者膜受體MT1與核受體RORɑ表達(dá)與QMGs評(píng)分均無相關(guān)性(表2)。

表2 MG患者QMGs評(píng)分與褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)是維持免疫平衡的基本網(wǎng)絡(luò),在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。褪黑素是由松果體在夜間分泌的激素,是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵分子之一[8],對(duì)維持免疫平衡起重要作用。MG作為典型的自身免疫性疾病,有關(guān)褪黑素在MG中的作用卻鮮有研究,為進(jìn)一步探討褪黑素在MG中的作用,本研究檢測(cè)了MG患者血清褪黑素水平及褪黑素受體系統(tǒng)的表達(dá),并與疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行相關(guān)性分析。

體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):T細(xì)胞與B細(xì)胞均表達(dá)褪黑素受體,褪黑素通過與其受體結(jié)合發(fā)揮抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等生理功能,研究人員發(fā)現(xiàn)敲除MT1受體的小鼠在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中抑郁癥發(fā)病率升高,在一些抑郁癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗MT1抗體升高,提示MT1抗體激動(dòng)劑或可減輕抑郁癥患者癥狀[9];在亨廷頓小鼠模型中,褪黑素可以通過與MT1受體結(jié)合抑制線粒體性細(xì)胞凋亡通路,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)功能[10];對(duì)淋巴細(xì)胞,褪黑素通過與其膜受體MT1結(jié)合抑制IL-17的產(chǎn)生[11];在SLE小鼠模型中,經(jīng)褪黑素治療的小鼠T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),抗ss-DNA和抗組蛋白的自身Ig M抗體減少,IL-6和IL-13分泌降低,IL-2分泌增多[12],對(duì)SLE癥狀有改善作用。

本研究發(fā)現(xiàn),MG患者與健康對(duì)照相比血清褪黑素水平并無改變,為排除晝夜節(jié)律及免疫抑制劑藥物對(duì)褪黑素分泌的影響,本研究將血液標(biāo)本采集時(shí)間統(tǒng)一規(guī)定在上午9:00至10:00。分別對(duì)使用和未使用免疫抑制劑的患者以及健康人血清褪黑素水平進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)MG患者無論是否使用免疫抑制劑,血清褪黑素水平與健康人均沒有明顯差異,且兩者間血清褪黑素水平也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,MG患者血清褪黑素水平與QMGs評(píng)分無相關(guān)性。上述結(jié)果提示MG患者褪黑素的分泌情況與其病情嚴(yán)重程度無關(guān)。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)MG患者褪黑素膜受體MT1的表達(dá)與正常對(duì)照相比顯著降低(P＜0.05),結(jié)合前述結(jié)果推測(cè)褪黑素通過膜受體MT1發(fā)揮的調(diào)節(jié)功能在MG患者中可能存在缺陷。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)MG患者與健康對(duì)照相比血清褪黑素水平并無改變,但MG者PBMCs褪黑素膜受體MT1的表達(dá)降低,提示褪黑素通過膜受體MT1發(fā)揮調(diào)節(jié)功能在MG患者中可能存在缺陷。但本研究納入病例數(shù)較少,設(shè)計(jì)可能存在一定局限性,為進(jìn)一步明確褪黑素在MG中的可能作用,仍需要大樣本及有關(guān)機(jī)制研究。