石 萍 魯增輝 游華建 賀元川 張德利 邢康康 陳仕江

(重慶市中藥研究院, 重慶 400065)

動(dòng)物腸道內(nèi)棲息了數(shù)量龐大的微生物群落, 這些微生物群在宿主腸道構(gòu)成了復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、宿主免疫功能調(diào)節(jié)、有害微生物侵害防御等方面具有重要作用[1—3]。研究表明, 動(dòng)物腸道微生物菌群組成及變化, 可能受到多種因素的影響, 如飼料[4]、日齡[5,6]、免疫狀態(tài)[7]、環(huán)境因素[8]、抗生素治療[9]和應(yīng)激[10]等。因此, 研究動(dòng)物腸道微生物菌群及在特定情況下的變動(dòng), 對(duì)于闡明腸道微生物促進(jìn)動(dòng)物體的消化吸收、生長發(fā)育、免疫防御等方面具有重要意義, 對(duì)于補(bǔ)充詮釋宿主-腸道菌群互作機(jī)制也具有重要價(jià)值。

醫(yī)學(xué)蛭類如歐洲醫(yī)蛭(Hirudo medicinalis)、側(cè)紋醫(yī)蛭(Hirudo verbana)等體內(nèi)含有大量抗凝、抗血栓等生物活性成分, 而被廣泛研究。醫(yī)蛭體內(nèi)的腸道微生物與宿主的共生關(guān)系以及對(duì)宿主的有益效果, 也是科學(xué)界研究的重點(diǎn)。日本醫(yī)蛭(Hirudo nipponiaWhitman, 1886)隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門蛭綱無吻蛭目醫(yī)蛭屬[11], 是中國藥典(2015年版)收載的唯一吸食動(dòng)物血液的水蛭藥材種類[12]。臨床研究表明, 水蛭在治療動(dòng)脈粥樣硬化[13]、高脂血癥[14]、抗血栓[15]、抗腫瘤[16]、抗炎癥[17]等方面有較好的療效。日本醫(yī)蛭藥用史最早可追溯至《神農(nóng)本草經(jīng)》, 由于其體內(nèi)含有世界上最強(qiáng)的天然抗凝血酶類物質(zhì)—水蛭素, 因此具有極強(qiáng)的抗凝血酶活性和抗血小板聚集作用[18]。以日本醫(yī)蛭為原料的脈血康膠囊在治療心腦血管疾病方面具有極好的市場反應(yīng), 產(chǎn)品供不應(yīng)求[19]。受環(huán)境污染、人為過度捕撈、棲息地急劇萎縮等因素的影響, 日本醫(yī)蛭野外種群量急劇下降, 曾經(jīng)遍布全國的日本醫(yī)蛭, 現(xiàn)在難尋其蹤。本課題組開展了多年日本醫(yī)蛭人工養(yǎng)殖研究及實(shí)踐。在人工養(yǎng)殖過程中, 課題組發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭能夠在饑餓狀態(tài)下維持生命體征長達(dá)半年以上, 處于饑餓狀態(tài)的醫(yī)蛭在喂食血液后, 能夠急劇生長。推測是存在于日本醫(yī)蛭體內(nèi)的腸道微生物菌群發(fā)揮了極其重要的作用。

現(xiàn)階段關(guān)于日本醫(yī)蛭腸道微生物菌群、饑餓及恢復(fù)攝食對(duì)日本醫(yī)蛭腸道微生物菌群影響等方面的研究, 還未見任何報(bào)道。為此本課題組利用不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)的高通量測序技術(shù), 對(duì)饑餓及恢復(fù)攝食狀態(tài)下的日本醫(yī)蛭腸道微生物菌群進(jìn)行了研究。以期揭示日本醫(yī)蛭腸道微生物菌群組成、腸道微生物菌群對(duì)日本醫(yī)蛭不同攝食狀態(tài)的反應(yīng)以及可能發(fā)揮的作用, 為日本醫(yī)蛭人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化、腸道微生物菌群對(duì)日本醫(yī)蛭有益作用機(jī)制研究等奠定基礎(chǔ), 也為其他宿主-腸道微生物互作機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用日本醫(yī)蛭均來源于重慶市中藥研究院水蛭養(yǎng)殖基地。各選取100尾健康無病、表面無傷痕、個(gè)體大小相近的日本醫(yī)蛭正常個(gè)體, 分別暫養(yǎng)于4個(gè)相同的養(yǎng)殖網(wǎng)箱。其中1個(gè)網(wǎng)箱饑餓處理30d (JE), 1個(gè)為正常飼養(yǎng)對(duì)照組(DZ), 另外2組均饑餓30d后喂食1次, 投喂結(jié)束后第7、第14天取樣,分別記作F7、F14。整個(gè)養(yǎng)殖期間, 水溫20—22℃,溶氧≥5 mg/L, pH=7.0±0.2, 飼料為新鮮健康豬血。各組分別設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)選取10尾日本醫(yī)蛭。

1.2 腸道菌群收集

實(shí)驗(yàn)日本醫(yī)蛭用75%酒精體表消毒, 于無菌條件下, 1.5 mL離心管收集腸道及其內(nèi)容物, 做好標(biāo)記后液氮凍存。

1.3 基因組抽提

采用CTAB/SDS方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度, 使用無菌水將DNA濃度稀釋至1 ng/μL。

1.4 16S rRNA基因序列的擴(kuò)增

以稀釋后的基因組DNA為模板, 選取細(xì)菌基因組16S區(qū)域中V4區(qū)作為擴(kuò)增區(qū)域, 用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR。擴(kuò)增V4區(qū)引物以515F (5′-GTGCC AGCMGCCGCGGTAA-3′)及806R (5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′)上加有接頭和測序引物序列, 同時(shí)反向引物上另接有12個(gè)不同堿基的標(biāo)簽(Barcode)序列以區(qū)分不同樣品[20]。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Qiangen膠回收試劑盒(Qiagen Gel Extraction Kit,Qiagen, Germany)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收純化。

1.5 16S rRNA文庫構(gòu)建

按照TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA)說明手冊(cè)進(jìn)行文庫構(gòu)建。文庫質(zhì)檢采用Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100 system。在Illumina HiSeq2500測序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測序。測序服務(wù)由北京諾禾致源生物公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù), 截去Barcode和引物序列后使用FLASH (Version 1.2.7)[21]對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接, 獲得Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags); 參照Qiime (Version 1.7.0)[22]的Tags質(zhì)量控制流程, 過濾去除低質(zhì)量、短長度及嵌合體后得到高質(zhì)量、用于分析的Tags數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

利用Uparse軟件(Version7.0.1001)[23]對(duì)所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類, 以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs (Operational Taxonomic Units)。選取OTUs的代表性序列, 進(jìn)行注釋分析, 利用Mothur方法與SILVA[24]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[25]進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8—1), 獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平: phylum (門)、class (綱)、order (目)、family (科)、genus (屬)、species (種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Observedspecies, Chao1, Shannon, ACE等指數(shù), 使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線以及Venn圖, 并使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析, 通過多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法主成分分析(PCA, Principal Component Analysis)、主坐標(biāo)分析(PCoA, Principal Coordinates Analysis)、 無度量多維標(biāo)定法(NMDS,Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)等方法, 從中發(fā)現(xiàn)不同樣品(組)間的差異。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及測序數(shù)據(jù)合理性分析

分別抽提日本醫(yī)蛭(F7、F14、JE、DZ四組樣品)腸道細(xì)菌基因組DNA, 以基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增16S rRNA目的基因后, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確, 總量滿足2次或者2次以上建庫需要, 可進(jìn)行后續(xù)建庫試驗(yàn)。

Coverage指數(shù)是對(duì)測序樣品覆蓋率的描述, 根據(jù)表1可見, 4組樣品覆蓋率均很高(≥99.8%), 說明樣本序列中未被檢測出的概率很低。稀疏曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性。從稀釋曲線(圖1A)可見, 在小于約5000條序列時(shí), OTU數(shù)量隨著樣品的序列數(shù)增加而迅速增加; 在5000—30000條序列時(shí), OTU數(shù)量增加緩慢, 之后則趨向平坦。本研究的4個(gè)樣品均處于平臺(tái)期(圖1A), 說明測序數(shù)據(jù)量合理。測序原始數(shù)據(jù)提交至NCBI (Accession num-ber: SRP 126606)。

2.2 日本醫(yī)蛭腸道菌群多樣性分析

采用α和β多樣性分析, 對(duì)日本醫(yī)蛭攝食前后腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)組成變化進(jìn)行描述和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示, 4組樣品獲得最終用于分析的有效序列平均條數(shù)分別為59791±13967 (F7)、49140±15751(F14)、53379±10679 (JE)和62692±4529 (DZ),OTU數(shù)目變化中, F7組最高(表1)。Ace和Chao1指數(shù)對(duì)菌群物種總數(shù)評(píng)估發(fā)現(xiàn), F7＞F14＞DZ＞JE。

Venn圖(圖1B)結(jié)果顯示, 4組樣品共有111個(gè)OTU, 4組樣品獨(dú)有OTU分別為F7∶F14∶DZ∶JE=333∶112∶30∶26。PCA主成分分析和PCoA主坐標(biāo)分析結(jié)果(圖1C、1D)顯示, 4組樣品菌群結(jié)構(gòu)有一定的差異。β多樣性結(jié)果也顯示四組樣品組間有一定的差異(圖1E)。

表1 四組樣品α多樣性分析結(jié)果Tab. 1 Alpha Diversity of four sets of samples

圖1 稀釋曲線(A)、樣品維恩圖(B)、PCA分析圖(C)、PCoA分析圖(D)和NMDS分析圖(E)Fig. 1 Rarefaction curves (A); Venn diagram of OTU in the four groups (B); PCA analysis (C); PCoA analysis (D); NMDS analysis (E)

2.3 日本醫(yī)蛭腸道菌群豐度變化

在所有實(shí)驗(yàn)日本醫(yī)蛭腸道中, 變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)以及厚壁菌門(Firmicutes)均占據(jù)了95%以上(圖2A、2B)。同時(shí), 在所有樣品中均檢測出氣單胞菌屬(Aeromonas)、Mucinivorans屬以及丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)(圖2C), 3種菌屬豐度之和在4組樣品中均超過了60%(表2), 擬桿菌屬(Bacteroides)豐度僅次于上述菌屬。但無論是組內(nèi)還是組間都存在一定的差異,說明饑餓及恢復(fù)攝食對(duì)日本醫(yī)蛭腸道菌群的構(gòu)成存在一定影響。同時(shí)也表明氣單胞菌屬、Mucinivorans屬、擬桿菌屬以及丹毒絲菌屬等是日本醫(yī)蛭核心腸道微生物群。

門分類水平下腸道菌群豐度的變化門水平腸道豐度的變化詳見表2和圖3。在饑餓及恢復(fù)攝食狀態(tài)下日本醫(yī)蛭腸道菌群的變化, 在門水平表現(xiàn)為: 變形菌門在對(duì)照組最高, 擬桿菌門在恢復(fù)攝食14d后豐度最高。厚壁菌門在饑餓組豐度值最高。

屬分類水平下腸道菌群豐度的變化變形菌門的氣單胞菌屬、擬桿菌門的擬桿菌屬、厚壁菌門的漫游球菌屬(Vagococcus)均是在饑餓后恢復(fù)攝食7d時(shí), 達(dá)到最高。Mucinivorans在饑餓后恢復(fù)攝食14d組達(dá)到最高, 丹毒絲菌屬在饑餓狀態(tài)下豐度最高(圖3和表2)。

差異類群LEfSe分析通過LEfSe (Linear Discriminate Analysis Effect Size)分析發(fā)現(xiàn), 饑餓后恢復(fù)喂食7d組日本醫(yī)蛭腸道菌群中科和屬分類水平上存在差異菌群, 如擬桿菌科、擬桿菌屬(圖4)。

圖2 各樣品腸道菌群組成結(jié)構(gòu)Fig. 2 Gut microbial community structure of samples

表2 四組樣品腸道菌群相對(duì)豐度分布表Tab. 2 The relative abundance of H.nipponia gut microbiota in four groups (n=3, )

表2 四組樣品腸道菌群相對(duì)豐度分布表Tab. 2 The relative abundance of H.nipponia gut microbiota in four groups (n=3, )

種名Species分類Taxonomy F7 F14 DZ JE變形菌門Proteobacteria Phylum 0.4767±0.0004 0.4232±0.0010 0.5227±0.0260 0.3549±0.0537擬桿菌門Bacteroidetes Phylum 0.3399±0.0105 0.4976±0.0009 0.3930±0.0194 0.3468±0.0038厚壁菌門Firmicutes Phylum 0.1622±0.0109 0.0390±0.0000 0.0389±0.0003 0.2808±0.0310氣單胞菌屬Aeromonas Gunus 0.3900±0.0039 0.2840±0.0070 0.3122±0.0115 0.2281±0.0619 Mucinivorans Gunus 0.1440±0.0226 0.2778±0.0070 0.0948±0.0002 0.2648±0.0016丹毒絲菌屬Erysipelothrix Gunus 0.1285±0.0149 0.0268±0.0001 0.0263±0.0002 0.2202±0.0184擬桿菌屬Bacteroides Gunus 0.1028±0.0188 0.0099±0.0000 0.0106±0.0000 0.0066±0.0000脫硫弧菌屬Desulfovibrio Gunus 0.0061±0.0000 0.0281±0.0005 0.0643±0.0019 0.0069±0.0000 Unidentified_JTB215 Gunus 0.0104±0.0000 0.0036±0.0000 0.0044±0.0000 0.0232±0.0002漫游球菌屬Vagococcus Gunus 0.0133±0.0001 0.0018±0.0000 0.0021±0.0000 0.0022±0.0000

3 討論

3.1 饑餓后恢復(fù)攝食對(duì)日本醫(yī)蛭腸道菌群多樣性的影響

動(dòng)物體內(nèi)的微生物群落在宿主營養(yǎng)代謝及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用[26]。研究表明, 餌料的恢復(fù)投喂一方面增加了能量來源并使得微生物數(shù)量增加, 另一方面使得腸道微生物種間競爭加劇,加速形成“優(yōu)勢種”并導(dǎo)致各微生物種類和豐度的分化[27—29]。本研究利用高通量測序技術(shù)分析了饑餓及恢復(fù)攝食對(duì)日本醫(yī)蛭腸道菌群組成及多樣性特征的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 饑餓后恢復(fù)投喂, 日本醫(yī)蛭腸道微生物多樣性依次為F7＞F14＞DZ＞JE, 與相關(guān)研究結(jié)果相符[27—29]。具體表現(xiàn)為, 喂食7d組腸道微生物多樣性最高, 饑餓組最低。OTU數(shù)據(jù)顯示與此一致的規(guī)律。

圖3 四組樣品腸道菌群相對(duì)豐度分布圖Fig. 3 Relative abundance of H. nipponia gut microbiota in four groups

3.2 饑餓后恢復(fù)喂食對(duì)日本醫(yī)蛭腸道菌群豐度及種類的影響

由于所處的宿主腸道生長環(huán)境與周圍環(huán)境緊密相關(guān), 水生動(dòng)物腸道微生物菌群平衡更容易受到水體環(huán)境變化、餌料變換等因素的影響。對(duì)饑餓及恢復(fù)攝食狀態(tài)下日本醫(yī)蛭腸道菌群豐度變化研究發(fā)現(xiàn): 在門水平, 變形菌門、擬桿菌門及厚壁菌門在正常組、饑餓組以及恢復(fù)攝食組均占據(jù)了95%以上, 為優(yōu)勢菌門。與同屬于醫(yī)蛭屬的東方醫(yī)蛭優(yōu)勢腸道菌群類似[30,31], 與魚類優(yōu)勢腸道菌群也有共同之處[32,33]。這表明在饑餓后恢復(fù)攝食影響了日本醫(yī)蛭優(yōu)勢菌門的豐度, 但未影響優(yōu)勢菌門的種類。與現(xiàn)有魚類及其他脊椎動(dòng)物研究的結(jié)果略為不同, 饑餓及恢復(fù)攝食對(duì)魚類等脊椎動(dòng)物優(yōu)勢菌群豐度和種類均可能產(chǎn)生一定的影響[27,34,35], 但在本研究中日本醫(yī)蛭優(yōu)勢菌門種類卻幾乎未變, 究其原因可能與魚類及其他陸生脊椎動(dòng)物喂食的飼料,本身就含有較多的外源微生物, 而本研究中日本醫(yī)蛭系人工飼養(yǎng), 以消毒的腸衣填充新鮮健康豬血投喂, 因而所含的外源微生物較少有關(guān)。

在屬分類水平, 以氣單胞菌屬、Mucinivorans屬、擬桿菌屬以及丹毒絲菌屬等組成了日本醫(yī)蛭核心腸道微生物群, 這一發(fā)現(xiàn)與已有歐洲醫(yī)蛭[36]、側(cè)紋醫(yī)蛭[37]、東方醫(yī)蛭[38]以及北美醫(yī)蛭[39]研究結(jié)果基本一致。氣單胞菌屬具有溶解血細(xì)胞的溶血素功能[40], 可參與消化醫(yī)蛭攝食的血液[41]。在本研究中, 日本醫(yī)蛭在饑餓恢復(fù)攝食后, 氣單胞菌屬數(shù)量迅速上升, 可能與食物消化等功能相關(guān)。Mucinivorans為理巖菌科新屬[42,43], 該菌參與厭氧代謝, 并利用碳水化合物作為能量來源[44], 將葡萄糖、乳糖、甘露糖和蜜二糖等代謝為醇類、乙酸、丙酸、甲酸和琥珀酸[42], 還可以代謝水蛭腸細(xì)胞分泌的黏液, 為腸道微生物菌群定植提供有利條件[40]。本研究中饑餓的日本醫(yī)蛭在攝食后,Mucinivorans出現(xiàn)不同水平的回升, 與已有研究結(jié)果一致[45,46]?？赡苁怯捎谌毡踞t(yī)蛭吸食血液后,Mucinivorans參與食物中碳水化合物代謝, 為機(jī)體提供能量有關(guān)[46]。脫硫弧菌屬、擬桿菌屬均在饑餓攝食后水平有所回升, 可能與日本醫(yī)蛭的消化、營養(yǎng)吸收等功能也較為相關(guān)。此外, 丹毒絲菌屬在饑餓狀態(tài)下水平達(dá)到最高, 其具體功能及作用還有待進(jìn)一步研究。

圖4 組間差異顯著物種分析圖Fig. 4 Difference in dominant microorganisms between groups