陳駕君，楊 帆，解 杰，王 翔，高 偉，白祥軍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科，武漢 430030)

擠壓傷及擠壓綜合征是創(chuàng)傷救治中的常見傷，救治效果不佳，具有極高的病死率[1]。其主要危害機(jī)制為解除壓迫后的骨骼肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/R)，這種序貫性的損傷可導(dǎo)致失控性炎性反應(yīng)，繼而出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[2]。缺血再灌注損傷發(fā)生和發(fā)展是擠壓綜合征中的重要環(huán)節(jié)，如何在源頭上控制炎性反應(yīng)，減輕毒素回吸收對(duì)機(jī)體造成的危害，成為臨床研究的重點(diǎn)目標(biāo)之一。本院創(chuàng)傷外科利用負(fù)壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)技術(shù)在臨床上治療擠壓傷取得了良好效果[3]，但是該技術(shù)通過對(duì)損傷骨骼肌的局部作用，減輕缺血再灌注損傷和繼發(fā)全身炎性反應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確。因此，筆者通過缺血再灌注損傷動(dòng)物模型模擬擠壓傷，結(jié)合前期兔創(chuàng)面模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[4-7]，來探討VSD技術(shù)在擠壓傷時(shí)對(duì)炎癥因子、炎癥細(xì)胞和炎性反應(yīng)的干預(yù)作用，以闡明其在減輕骨骼肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性新西蘭白兔30只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量2～3 kg，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)所涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與科學(xué)操作均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2動(dòng)物模型的建立 將新西蘭白兔按照150 mg/kg的劑量，從耳緣靜脈注射鹽酸氯胺酮注射液，麻醉成功后固定于操作臺(tái)。缺血再灌注損傷模型制備：將白兔左后腿中部以上的皮膚剃毛、消毒后剪開，于大腿根部游離股動(dòng)、靜脈并予以保護(hù)，大腿中上水平切斷所有肌肉及神經(jīng)，將離斷的肌肉進(jìn)行原位縫合，使左下肢成為僅通過股動(dòng)、靜脈及骨骼與肢體連接的組織塊；使用無創(chuàng)傷血管夾阻斷股動(dòng)、靜脈造成下肢缺血(持續(xù)4 h)，然后放開血管夾，造成再灌注損傷(持續(xù)6 h)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 將30只實(shí)驗(yàn)兔分為3組，即對(duì)照組、缺血再灌注組(I/R組)、VSD干預(yù)的缺血再灌注組(I/R+VSD組)，每組10只：(1)對(duì)照組動(dòng)物僅完成組織游離，不進(jìn)行左下肢靜脈的夾閉及開放；(2)I/R組動(dòng)物完成組織游離后進(jìn)行左下肢靜脈的夾閉及開放，不進(jìn)行VSD干預(yù)；(3)I/R+VSD組的動(dòng)物在進(jìn)行再灌注的同時(shí)對(duì)損傷處予以VSD干預(yù)。術(shù)中VSD負(fù)壓控制在-125 mm Hg(-16.6 kpa)，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將兔用空氣栓塞法處死，取相應(yīng)部位組織進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定和組織學(xué)分析，對(duì)外周靜脈血進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4儀器與試劑 (1)儀器：便攜式負(fù)壓吸引儀(武漢維斯第公司)、Cell-PYN Sapphire全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)Abbott公司)。(2)材料：VSD一次性負(fù)壓引流護(hù)創(chuàng)材料(武漢維斯第公司)、特制飼養(yǎng)籠(武漢同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。(3)試劑：①酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)TNF-α和IL-6檢測(cè)試劑盒(北京博奧森公司)、PGE2檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Ebioscience公司)、C5a檢測(cè)試劑盒(上?？祈樄?、CRP檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Dade Behring公司)；②免疫組織化學(xué)法(IHC)小鼠CD11b試劑盒(上海賓智公司)、羊抗小鼠IgG(上海研生公司)；③蛋白免疫印跡法(Western blot)：小鼠hs-CRP試劑盒(上海研生公司)。

表1 各組家兔骨骼肌組織中各生化指標(biāo)的表達(dá)情況

*：P<0.05；**：P<0.01，與對(duì)照組比較；Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01，與I/R組比較；-：無數(shù)據(jù)

1.5樣本取材和檢測(cè)方法 (1)炎癥因子組織標(biāo)本：各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將兔處死，使用冰去離子水對(duì)獲取的兔左下肢骨骼肌組織進(jìn)行沖洗并進(jìn)行勻漿處理，使用低溫離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取上清液以ELISA法進(jìn)行TNF-α、IL-6、PGE2和C5a的檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。(2)炎癥標(biāo)志物組織標(biāo)本：本實(shí)驗(yàn)引入GAPDH蛋白作為內(nèi)參，采用免疫印跡法檢測(cè)hs-CRP蛋白的表達(dá)。取漂洗干凈的骨骼肌組織，提取總蛋白進(jìn)行15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉過夜后依次加入鼠抗兔hs-CRP一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。(3)炎癥細(xì)胞組織標(biāo)本：同上，采用IHC法檢測(cè)組織內(nèi)多形核中性白細(xì)胞(PMN)特異性標(biāo)記物CD11b的表達(dá)。(4)炎癥因子血液標(biāo)本：各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將兔處死前，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1 mL，使用低溫離心機(jī)以3 000 r/min離心5 min，取上清液以ELISA法進(jìn)行TNF-α和IL-6的檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。(5)炎癥標(biāo)志物血液標(biāo)本：同上采用ELISA法，檢測(cè)兔外周靜脈血中CRP水平。(6)炎癥細(xì)胞血液標(biāo)本：同上抽取靜脈血1 mL注入血常規(guī)試管，低溫保存，60 min內(nèi)送往華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，應(yīng)用Cell-PYN Sapphire全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀自動(dòng)進(jìn)行WBC計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1骨骼肌組織中炎癥因子水平的變化 在建模過程中，I/R組和VSD組各有1只白兔死亡。與對(duì)照組比較，I/R組TNF-α、IL-6、PGE2和C5a水平均顯著增高(t=5.157，P<0.01)，I/R+VSD組TNF-α和C5a水平顯著增高(t=2.373，P=0.035)；與I/R組比較，I/R+VSD組的TNF-α、IL-6、PGE2和C5a均顯著降低(t=4.699，P<0.01)，見表1。

2.2骨骼肌組織中炎癥標(biāo)志物水平的變化 免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、I/R組和I/R+VSD組hs-CRP蛋白相對(duì)灰度比分別為0.738±0.467，2.341±0.773和1.299±0.391。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，3組相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.453，P<0.01)，見圖1。

*：P<0.05；**：P<0.01，與對(duì)照組比較；Δ：P<0.05，與I/R組比較

圖1 骨骼肌組織中炎癥標(biāo)志物水平的變化

*：P<0.05；**：P<0.01，與對(duì)照組比較；Δ：P<0.05，與I/R組比較；-：無數(shù)據(jù)

圖2 骨骼肌組織中炎癥細(xì)胞數(shù)量的變化

2.3骨骼肌組織中炎癥細(xì)胞數(shù)量的變化 免疫組化法檢測(cè)及圖像分析結(jié)果顯示，對(duì)照組、I/R組和I/R+VSD組PMN特異性標(biāo)記物CD11b表達(dá)分別為113±58，362±101和252±87。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，3組PMN細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.448，P<0.01)，見圖2。

表2 各組家兔靜脈血中各生化指標(biāo)的表達(dá)情況

*：P<0.05；**：P<0.01，與對(duì)照組比較；Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01，與I/R組比較；-：無數(shù)據(jù)

2.4外周靜脈血中炎癥因子、炎癥標(biāo)志物水平和炎癥細(xì)胞數(shù)量的變化 與對(duì)照組比較，I/R組TNF-α、IL-6、CRP水平和WBC數(shù)量顯著增高(t=9.247，P<0.01)，I/R+VSD組TNF-α、IL-6和CRP水平顯著增高(t=4.754，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+VSD組的TNF-α、IL-6、CRP水平和WBC數(shù)量顯著降低(t=7.415，P<0.01)，見表2。

3 討 論

臨床上擠壓傷起病急驟，在機(jī)械力和再灌注損傷的雙重機(jī)制可迅速出現(xiàn)全身失控性炎性反應(yīng)，同時(shí)常伴有急性腎功能不全，繼發(fā)各種器官功能損害，病死率較高，所以擠壓傷和擠壓綜合征是臨床上治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。擠壓綜合征發(fā)病機(jī)制主要為肌肉等組織受到機(jī)械力作用，直接損傷和缺血引起的變性、壞死及解除擠壓后再灌注損傷導(dǎo)致的自溶[8]。有時(shí)，即使擠壓時(shí)間不長(zhǎng)，沒有造成嚴(yán)重的器質(zhì)性損傷，也會(huì)由于解除擠壓后，組織內(nèi)自由基釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和橫紋肌壞死溶解，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)和不可逆的損傷。其中，骨骼肌是受缺血再灌注損傷最為敏感的機(jī)體組織[9]，缺血骨骼肌的細(xì)胞在恢復(fù)供血后的最初幾分鐘內(nèi)即可發(fā)生再灌注損傷，裂解后誘導(dǎo)釋放各種炎癥因子，并經(jīng)過靜脈回流，造成炎癥因子的全身播散和級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此骨骼肌也是擠壓傷后缺血再灌注損傷預(yù)防和治療的研究重點(diǎn)。

VSD技術(shù)是近十年來新興的一種創(chuàng)面物理治療技術(shù)[10]，可明顯預(yù)防和改善創(chuàng)面感染，加快創(chuàng)面愈合，已廣泛應(yīng)用于各種急慢性創(chuàng)面的治療中[11]。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外的臨床研究均表明[12-13]，應(yīng)用VSD技術(shù)可有效改善擠壓傷和擠壓綜合征造成的危害，但是具體作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。

適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)可以將細(xì)胞因子水平維持在適當(dāng)?shù)乃?，有利于?xì)胞免疫和機(jī)體恢復(fù)；如果炎性因子過度釋放和調(diào)節(jié)失控，則會(huì)誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，繼發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)。筆者推測(cè)，在缺血再灌注損傷中，VSD技術(shù)利用其負(fù)壓抽吸作用，可以有效去除組織內(nèi)積聚的有害物質(zhì)[14]，減少炎癥因子釋放及炎癥細(xì)胞的進(jìn)一步趨化，下調(diào)炎性反應(yīng)，從而減輕擠壓傷后再灌注損傷引起的一系列嚴(yán)重后果，預(yù)防MODS的發(fā)生。在炎性反應(yīng)中，最為重要的炎癥因子是TNF-α、IL-6、PGE2和C5a，分別具有啟動(dòng)炎性反應(yīng)、活化炎癥因子、引起血管通透性增高和趨化炎癥細(xì)胞的作用。TNF-α是參與創(chuàng)傷后機(jī)體炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞因子之一[15]。IL-6則可由多種細(xì)胞合成和釋放，通過刺激血小板活化因子協(xié)同TNF-α放大炎性反應(yīng)[16]。PGE2是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產(chǎn)物，是前列腺素的一種，其作用為擴(kuò)張血管，升高血管通透性，利于炎癥細(xì)胞進(jìn)出血管壁[17]。C5a是存在于血清與組織液中的一種經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。活化后，高濃度的C5a是中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的趨化劑，可刺激這些細(xì)胞沿著濃度定向移動(dòng)致?lián)p傷部位發(fā)揮炎性反應(yīng)[18]。WBC是一種非特異性免疫的直接效應(yīng)細(xì)胞，活化的WBC還可以通過釋放炎癥因子、增加血管通透性、產(chǎn)生趨化作用等參加局部的炎性反應(yīng)。除非發(fā)生免疫抑制，WBC的增高是全身炎癥水平最為基礎(chǔ)的評(píng)判指標(biāo)，而PMN是白細(xì)胞中主要的效應(yīng)細(xì)胞[19]。CRP則主要是在IL-6等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)下，主要由肝臟合成分泌的一種蛋白質(zhì)，也可由炎癥局部的巨噬細(xì)胞少量產(chǎn)生。CRP以糖蛋白的形式存在于血液中，能增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性、激活補(bǔ)體等作用。CRP是急性時(shí)相蛋白(acute phase protein，APP)中變化最敏感的一種，而hs-CRP則是目前評(píng)價(jià)炎癥最為敏感的指標(biāo)之一[20]。因此，減少創(chuàng)傷處的局部炎癥因子，是阻斷缺血再灌注損的源頭，預(yù)防全身失控性炎性反應(yīng)和繼發(fā)MODS的重要途徑之一。

通過本實(shí)驗(yàn)可證實(shí)，VSD技術(shù)不僅可明顯下調(diào)再灌注損傷后兔骨骼肌局部的炎癥因子(TNF-α、IL-6、PGE2和C5a)的生成和表達(dá)，同時(shí)減少局部骨骼肌炎癥細(xì)胞(PMN)的浸潤(rùn)，降低局部炎性反應(yīng)；繼而減少炎癥因子(TNF-α和IL-6)進(jìn)入外周循環(huán)，改善全身炎性反應(yīng)，避免失控性炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而最終預(yù)防MODS。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過VSD技術(shù)，減少兔骨骼肌缺血再灌注損傷模型中炎癥因子的表達(dá)，控制炎癥細(xì)胞趨化，可有效下調(diào)局部和全身的炎癥水平。結(jié)合筆者之前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[3-4,21]，為其用于治療擠壓傷-擠壓綜合征-缺血再灌注損傷提供了理論依據(jù)。